Саркоцистоз крупного рогатого скота

     Kozar (1971) рекомендует окрашивать срезы раствором генциан-виолета в пропорции 1 : 5000 в течение 5 минут, 2—3 раза обесцвечивать по 5— 10 минут 1.5—2% уксусной кислотой, промывать дистиллированной водой, затем раздавливать в компрессориуме и просматривать под микроскопом.

     Согласно  модификации В. И. Голубкова, к 98 мл 2,5% раствора метиленовой сини добавляют 2 мл 0,1н азотной кислоты и 1—2 капли этой смеси наносят на срез, выдерживают 3—4 минуты, промывают дистиллированной водой, затем зажимают стеклами компрессориума и просматривают при малом увеличении под световым микроскопом. Автор рекомендует этот метод окраски как наиболее эффективный при исследовании дефростированного мяса.

1.8.4.2. Гистологический метод.

     Метод состоит из пяти этапов и более: I) фиксация; 2) консервирование; 3) приготовление гистологических срезов; 4) окрашивание и промывание срезов; 5) микроскопирование.

     Пробы тканей различных органов крупного рогатого скота, пораженного S. cruzi, фиксируются или в 10% забуференном формалине, или в жидкости Bouin, или в фиксаторе Helly. Часть проб после фиксации заливают парафином, затем готовят срезы толщиной 5 мкм, другую часть заливают метакрилатом и готовят срезы толщиной 3 мкм. Срезы окрашивают или гематоксилином-эозином, или гематоксилином, или парааминосалициловой кислотой.

     Для окраски срезов, фиксированных гликольметакрилатом, используют метод McManus для окрашивания гликогена; срезы обрабатывают 1% ПАСК в течение 10 минут, промывают дистиллированной водой в течение 5 минут, опять окрашивают ПАСК в течение 20 минут, промывают водопроводной водой 10 минут, затем в течение 30 минут окрашивают Gil-III-гематоксилином, подсинивают по Scott, промывают водопроводной водой в течение 2 минут. Пластические срезы (залитые парафином) промывают дистиллированной водой, дегитратируют 95%, затем 100% этанолом, очищенным ксилолом и готовят препараты в синтетической среде.

     Фиксация  проб тканей, пораженных саркоцистами, 10% забуференным формалином широко используется. В качестве фиксатора применяли также 2% забуференный глутаральдегид, раствор Bouin или фиксатор Helly.

     Из  консервированных парафином или  гликольметакрилатом проб готовили срезы толщиной 3—7 мкм и окрашивали их гематоксилином-эозином, ПАСК, ализаровым красным, красками von Koss, Nocht, Giemsa, ферроциа-нидом, по Wilderl, Gram, метиленовой синью, гематоксилином Heidenhain и другими красителями.

1.8.5. Извлечение саркоцист в физиологическом растворе.

     Метод предложен Erber (1977). Пробы мышц (10 г) разрезают на кусочки длиной 3 мм, помещают в колбу Эрленмейера с 50 мл физиологического раствора, добавляют стеклянные бусинки диаметром 4 мм, взбалтывают, затем суспензию пропускают через сито с диаметром отверстий 600— 700 мкм, центрифугируют. Осадок наносят на предметное стекло и препарат просматривают под световым микроскопом.

     Jungmann и Knoch (1980) модифицировали метод Erber (1977): при обнаружении саркоцист компрессорным методом, предварительно добавив каплю физиологического раствора, срезы переносят пинцетом в центрифужную пробирку,   затем добавляют 10-кратный объем (к объему мышечного среза) физиологического раствора, 10 стеклянных бусинок диаметром 4 мм, закрывают пробирку резиновой пробкой и встряхивают вручную 5— 8 минут. Удалив предварительно стеклянные бусинки проволочной петлей, центрифугируют 4—5 минут при 2000 об/мин, декантируют и весь осадок наносят на предметное стекло и микроскопируют при 160х и 640х увеличении.

     Метод извлечения саркоцист по Erber (1977) и  гистологический метод используют для дифференциации саркоцист различных видов рода Sarcocystis у одного и того же промежуточного хозяина.

1.8.6. Методы обнаружения мерозоитов.

1.8.6.1. Метод Козелкина (1928).

     С поверхности свежих срезов мышц лезвием  бритвы или скальпелем делают соскоб и наносят его на обезжиренное предметное стекло в виде мазка или делают мазок-отпечаток, подсушивают метиленовым или этиловым спиртом или спирт-эфирной смесью и окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 20 минут. При иммерсионной системе микроскопа в мерозоитах хорошо вилны светлые ядра с ярко-красными глыбками хроматина. Передняя часть мерозоита окрашивается в розовый, а задняя — в голубой цвет.

1.8.6.2. Метод Kozar (1971).

     Применяется для выявления мерозоитов из микросаркоцист. Навеску 2— 5 г исследуемой мышечной ткани переносят в ступку, добавляют 0,5— 2,0 мл физиологического раствора и тщательно растирают пестиком. Для исследования каплю полученной кровянистой жидкости помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют при среднем увеличении и слегка закрытой диафрагме.

1.8.6.3. Метод переваривания мышц в желудочном соке.

     П. А. Владимирова (1971) предложила ускоренный метод переваривания фарша с целью обнаружения Protozoa: навеску фарша (10 г) помещают в плоскодонную колбу, заливают 25-кратным количеством искусственного желудочного сока, составленного по прописи: 3 г пепсина, 1 г концентрированной соляной кислоты и 100 луг воды. Колбу помешают в термостат при 42—47°С на 4—5 часов, после чего содержимое колбы переносят в чашки Петри и просматривают их под микроскопом.

     О. В. Рыбалтовский (1971), используя основной принцип метода П. А. Владимировой, модифицировал его для выявления трофозоитов саркоцист в мышечной ткани.

     Навеску (2—3 г) исследуемой мышцы тщательно  измельчают, помещают в плоскодонную колбу и заливают 10-кратным объемом искусственного желудочного сока (в прописи П. А. Владимировой). Колбу помещают в термостат при 38—40° С на 1 час. Затем содержимое колбы фильтруют через мелкое ситечко в центрифужные пробирки. Центрифугируют при 1500—2000 об/мин в течение 2— 3 минут. Из осадка со дна пробирки пастеровской пипеткой берут 2—3 капли, наносят их на обезжиренные предметные стекла, делают мазки, высушивают и фиксируют спиртом. Красят по Романовскому-Гимза в течение не больше 10 минут, так как трофозоиты саркоцист очень быстро воспринимают краску после пребывания в искусственном желудочном соке. Мазки исследуют под иммерсией.

     Посредством метода переваривания мышц в желудочном соке, кроме эндозоитов, выявляются также целые микросаркоцисты (3. И. Кислякова, О. В. Рыбалтовский, 1980).

1.8.6.4. Метод переваривания мышц трипсином.

     Эффективным методом выделения трофозоиты (брадизоиты, мерозоиты, эндозоиты и др.) считается метод ферментативного переваривания мышечных тканей трипсином, предложенный Erber (1977). Навеску мышечной ткани (10 г) измельчают до кусочков величиной 3 мм, помещают в колбу Эрленмейера на 250 мл и добавляют 50 мл раствора трипсина и при постоянном перемешивании с использованием магнитной мешалки выдерживают при 20—23° С в течение 30 минут. Суспензию пропускают через сито с диаметром отверстий 600— 700 мкм, центрифугируют, осадок наносят на предметное стекло и просматривают при 500-кратном увеличении.

     Prestwood (1980) после грубого измельчения  исследуемых мышц (20 г) помещают навеску в колбу и заливают ее 10-кратным объемом переваривающего раствора (10 г пепсина, 1660 мл   водопроводной   воды, 13,3 мл концентрированной соляной кислоты). Пробы выдерживают в этом растворе 2 часа в термостате при 37°С. К концу переваривания содержимое колбы фильтруют, выделяя осадок. Осадок суспендируют в 15 мл воды, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, затем декантируют, переносят на предметное стекло и исследуют при 200—400-кратном увеличении. 

1.8.6.5. Гомогенатный метод.

     Erber (1977) выделял цистозоиты из саркоцист  путем измельчения мышц (50 г) при  помощи ножевого гомогенизатора с добавлением равного объема физиологического раствора. Из полученной суспензии готовят мазки, окрашивают по Гимза и исследуют под микроскопом при 500-кратном увеличении.

     Hinaidy (1980) модифицировал гомогенатный метод следующим образом: 20 г грубо измельченной мышечной ткани, очищенной от жира и слизистых оболочек, помещают в миксер, добавляют 80 мл физиологического раствора и гомогенизируют в течение 30 секунд. Суспензию дважды пропускают через сито с диаметром отверстий 1,5 и 1 мм и центрифугируют в течение 2 минут. Осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют при помощи стереомикроскопа при 25— 50-кратном увеличении.

1.8.6.6. Метод выдавливания мясного сока.

     Согласно  описанию А. А. Богуша (1976), навеску мяса (5 г) измельчают и растирают в ступке с добавлением 0,5—2,0 мл физиологического раствора. Пестиком раздвигают остатки мышц по краям ступки, а суспензию по каплям наносят с помощью пипетки на предметные стекла. Мазки можно фиксировать и окрашивать по Романовскому-Гимза. В этом случае препарат исследуют под иммерсией.

1.9. ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА МЯСА, ИНВАЗИРОВАННОГО САРКОЦИСТАМИ

     Основной вопрос заключается в том, является ли инфицированное саркоцистами мясо опасным для здоровья человека или нет? У людей, потребляющих в пищу саркоцистозное мясо, некоторые авторы не наблюдали клинических признаков заболевания. Однако в опытах, проведенных Heydorn (1977), Piekarski (1978), у людей, употребивших сырое свиное и говяжье мясо, зараженное саркоцистами, отмечались понос, тошнота, оцепенение.

     По сведениям Heydorn (1977), при заражении людей сырой говядиной от животных, получивших орально 420 тыс., 2 млн. и 500 тыс. спороцист S.suihominis, клинические симптомы более выраженные, чем при заражении спороцистами S. bovihominis в тех же дозах. В случае S. bovihominis через 3—6 часов наблюдалось легкое головокружение, тошнота, боли в животе, понос, усиленная перистальтика, а в случае S.suihominis — через 6—8 часов — сильный понос, тошнота, рвота, боли в животе и суставах, общая слабость.

     Говядина содержала много саркоцист, однако точное количество их не указывалось. Перед дачей волонтерам зараженной саркоцистами свинины Heydorn проводил трихинеллоскопию препаратов-оттисков. У трех волонтеров, проглотивших сырую свинину, содержащую в среднем в одном препарате 3—4, 7—10 и 9 саркоцист S.suihominis, клинические признаки были той же тяжести: сильный бескровный понос, тошнота, исчезновение аппетита, повышение температуры, общая слабость, боль в суставах, чувство   онемения.    Отмечена меньшая степень пораженности свинины саркоцистами и большая для человека патогенность зараженного мяса, а также сильная пораженность говядины и меньшая ее патогенность. Причина заболевания людей, употребивших зараженное саркоцистами мясо, по мнению Heydorn, заключается или в прямом воздействии паразитов на организм человека, или в отравлении саркоцистином. Говядина может быть выпущена в торговую сеть без ограничений, тогда как свинина должна быть подвергнута трихинеллоскопии и в случае сильного поражения — забракована.

Саркоспоридиоз кишечника человека широко изучен в Польше (Plot-kowiak, 1980). Вообще саркоспоридиоз кишечника человека выявляется только в результате копрологического исследования. В кале человека спороцисты обнаруживаются, начиная с 9-го дня после поедания зараженного мяса и их выделение может длиться несколько недель, месяцев и даже лет.

1.9.1. Качество саркоцистозного мяса.

     Качество говядины в большой мере зависит от тяжести хронического саркоцистоза животных. Мясо от пораженных животных пронизано саркоцистами (1:28 к весу туши, или 2—3 кг саркоцист на среднюю по весу говяжью тушу), в нем меньше доброкачественных мышц. Наличие зрелых саркоцист способствует разросту соединительной ткани и снижению упитанности животных (В. А. Бритов, 1970; 3. И. Кислякова, О. В. Рыбал-товский, 1980).

     Гистологические исследования выявили зернистую саркоплазму, распад мышечной ткани, прилегающей к саркоцистам, и лейкоцитарные инфильтраты. При сильном поражении (3—5 саркоцист в поле зрения микроскопа) вокруг саркоцист образуются резко выраженные инфильтраты. Наряду с исчезновением поперечной исчерченности, гомогенизацией и зернистой дистрофией саркоплазмы, в некоторых мышечных волокнах процесс воспалительно-дегенеративных изменений приводит к распаду волокон. Вокруг саркоцист скапливаются эозинофильные лейкоциты, по периферии развивается соединительная ткань, откладываются соли извести в виде глыбок, которые постепенно увеличиваются и превращаются в известковые конкременты. При сильном заселении скелетных мышц саркоцистами Ю. К. Горбов (1981) отмечает гидремичность и дряблость мышц, серозно-студенистую инфильтрацию межмышечной ткани. Многие авторы наблюдали в пораженной саркоцистами говядине серовато-зеленые очаги — эозинофильные инфильтраты. В очаговых инфильтратах в мышцах преобладает пролиферация гранулоцитов — нейтрофилов и, особенно, эозинофилов, а также соединительнотканных клеток — гистиоцитов. Эозинофилы, инфильтрируя мышцы, придают им типичный зеленоватый цвет.

     Таким образом, макроосмотр и гистологические исследования зараженной саркоцистами свинины и говядины выявляют прежде всего структурную деструкцию мышечной ткани — лейкоцитарные, гистиоцитарные, эозинофильные крупно-очаговые инфильтраты, ухудшающие качество мяса.

     Изучались гистологические препараты мышечной ткани пищевода, сердца, ножек диафрагмы, крупа, брюшных мышц крупного рогатого скота с различной степенью поражения ее саркоцистами (Н. С. Даныпин, М. С. Даныпина, 1974; М. С. Даньшина, Н. С. Даныпин, 1975, 1978). Саркоцистозную инвазию условно классифицировали как: сильную (свыше 60 саркоцист в 24 срезах), среднюю (21—60 саркоцист) и слабую (до 20 саркоцист). Всего исследовано 624 среза от 208 туш крупного рогатого скота, из них: 132 среза от 44 туш при слабой саркоцистозной инвазии; 108 срезов от 36 туш со средней степенью поражения, 279 срезов от 93 туш с сильной степенью поражения мышечной ткани саркоцистами и 105 срезов от 35 туш здоровых животных.