Саркоцистоз крупного рогатого скота

     При вскрытии павшей стельной коровы Е. Rimaila-Parnanen, S. Nikander (1980) нашли в скелетных мышца множество зеленоватых узлов диаметром 1—2 мм. Микроскопически авторы установили массивный эозинофильный миозит, клеточную инфильтрацию, отечность, фиброзно-тканевую пролиферацию, саркоцисты. Эозинофильные гранулемы создавали впечатление дегенерированной саркоцисты, но внутри гранулемы фрагменты саркоцисты найти не удалось.

     У внешне здоровых коров при послеубойном гистологическом исследовании в миокарде наряду с тонкостенными саркоцистами S. bovicanis выявлены очаговые инфильтраты из одноядерных клеток, расположенные между волокнами мышц, иногда периваскулярно. Пролиферат состоит в основном из макрофагов, лимфоцитов, иногда встречаются эозинофилы и нейтрофилы. Вокруг дегенерированных цист имеется воспалительная реакция, диффузный из одноядерных лейкоцитов инфильтрат.

     Таким образом, при гистологическом исследовании животных, пораженных саркоцистозом в естественных условиях, выявлены патоморфологические изменения в виде лейкоцитарного миозита (возможен и эозинофильный), миокардита, энцефаломиелита. Общее состояние животных зависит от интенсивности саркоцистозной инвазии скелетных мышц, сердца, мозга. При слабой инвазии животные переносят саркоцистоносительство бессимптомно — саркоцисты и патоморфологические изменения обнаруживаются только при послеубойном гистологическом исследовании; при сильной инвазии — развивается клиника, характеризующаяся такими признаками, как сердечная недостаточность, слабость мышц, неврологические нарушения.

     Р. Дженсен, Д. Маккей (1977), обсуждая вероятность связи между саркоцистозом и эозинофильным миозитом, определяют последний как подострое или хроническое бессимптомное заболевание, для которого характерно возникновение воспалительных очагов в скелетных мышцах и в миокарде. Иногда миокард поражается эозинофильным миозитом до такой степени, что возникает сердечная недостаточность, а обширный процесс в скелетных мышцах вызывает слабость и нарушение их функций. В мазках крови при этом не обнаруживают постоянной эозинофилии или какого-либо другого диагностически ценного отклонения. По характеру морфологических изменений авторы выделяют две формы эозинофильного миозита: 1) эозинофильный миозит, при котором большое число эозинофилов скапливается в тканях с разрушенной мышечной соединительной тканью; 2) саркоспоридиозный миозит, который характеризуется наличием эозинофилов и гранулем. В большинстве случаев эозинофильный миозит выявляется при послеубойной ветсанэкспертизе туш крупного рогатого скота или при вскрытии животных, павших от различных заболеваний. Поражения локализуются в сердце, языке, ножках диафрагмы и жевательных мышцах. Отдельные очаги имеют круглую или овальную форму диаметром до 1 мм. Иногда поражения проявляются в виде прожилок между мышечными волокнами. По цвету они желтовато-серые с зеленоватым оттенком. Очаги могут быть одиночными или множественными, с обширным распространением. Гистологическая картина зависит от стадии развития болезни. В свежих очагах пораженные мышечные волокна окружены большим количеством эозинофилов. В старых очагах наряду с эозинофилами обнаруживаются лимфоциты, одноядерные макрофаги, иногда фибробласты. Многие мышечные клетки постепенно заменяются соединительной тканью или экссудатом. Часто обнаруживаемые гранулемы, окруженные зоной эпителиоидных клеток, состоят из массы остатков гиалинизированных мышечных клеток и лейкоцитов; иногда они обызвествляются. В периферической части гранулем наблюдаются фибробласты, лимфоциты и эозинофилы. Саркоцисты вида S. fusiformis распространены хаотично как в здоровых, так и в пораженных тканях и мышцах. В старых и заживших поражениях эозинофилы заменены фибробластами, умеренным количеством лимфоцитов и одноядерных макрофагов.

     При хронической форме саркоцистоза чаще встречаются лейкоцитарный миозит (возможен и эозинофильный), миокардит, энцефаломиелит.

1.8.  ДИАГНОСТИКА

1.8.1. Серологическая диагностика саркоцистоза.

     Иммунологические  методы применяются с целью подтверждения  диагноза при вспышках острого саркоцистозного  заболевания в естественных условиях, а также при экспериментальном заражении животных. Основная цель опытов заключалась в выявлении значения титров к саркоцистозным антигенам, по которым можно было бы с уверенностью судить о заражении животных. Однако широкое использование серологических методов диагностики саркоцистоза in vivo сдерживается трудностями получения активного саркоцистозного антигена.

     Для получения саркоцистозного антигена используется разработанный в 1980—1982 гг. метод культивирования содержимого саркоцист на искусственной полусинтетической питательной среде.

     Предложенный  метод изготовления саркоцистозного  антигена заключается в следующем: жидкость, полученную после механического измельчения и обработки раствором Hanks'a скелетных мышц, инва-зированных саркоцистами, высевают в объеме 0,2—0,5 мл на полусинтетическую питательную среду и выдерживают в термостате 48— 72 ч при t = 37—38°С. Выросшие колонии клонируют 3—4 раза. Идентифицированные под световым микроскопом клетки смывают 1% раствором формалина и выдерживают 12—15 ч при t = 4°C. Затем культуру очищают 5—6-кратным промыванием стерильным физиологическим раствором и центрифугируют 5 мин при 1,5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок в качестве антигена хранят при 1 = 3—4°С не более 7—10 суток.

     Для проверки специфичности полученного антигена ставят реакцию агглютинации (РА) с сывороткой крови животных-носителей саркоцист.

     В настоящее время большое значение придается сравнению результатов серодиагностики и гистологических исследований. Самым высоким титрам серологических реакций обычно соответствуют шизогональная стадия развития паразита и стадия незрелых саркоцист, проявляющиеся в клинике острого саркоцистоза. Однако особенный интерес представляют исследования по выявлению значений титров антител при хронической форме саркоцистоза, которая развивается в случае заражения животных малой дозой инфекционного начала (спороцист), что ведет к образованию незначительного количества меронтов и саркоцист и способствует субклиническому течению заболевания.

     Серологические  исследования с целью прижизненного  выявления саркоцистоза у крупного рогатого скота проводили с использованием саркоцистозного антигена, приготовленного из вегетативных стадий саркоцист, выращенных в культуре на полусинтетической питательной среде.

     Для определения интенсивности образования антител в ответ на искусственное инфицирование травоядных животных, а также на их заражение в естественных условиях возбудителем саркоцистоза использовали различные иммунологические методы.

  Реакция связывания комплемента (РСК)- применяют РСК для выявления антител.

  Реакция гемагглютинации антиглобулином непрямая Кумбса (РГААН)- определяют неспецифические агглютинины и гемолизины у телят, зараженных спороцистами S. bovicanis.

     Кровь собирали в вакуумные пробирки и замораживали. Хранили при t= —75°С. Для проведения РГААН использовали кроличий anti-bovine-глобулин, инактивированный нагреванием до t = 56°C в течение 30 мин и адсорбированный на эритроцитах здорового теленка, промытых физиологическим раствором. Две капли 2% суспензии эритроцитов здорового теленка смешивали с двумя каплями испытуемой сыворотки, выдерживали при t = 37°C в течение 15 мин, трижды промывали физиологическим раствором, ресуспендировали в 2% физиологическом растворе, смешивали с двумя каплями кроличьего anti-bovine-глобулии. Затем инкубировали в течение 30 мин при t = 4°C и проводили макро- и микроскопические исследования реакций агглютинации и гемолизиса. Все пробы сыворотки, взятой у зараженных спороцистами  S. bovicanis телят,  имели отрицательные титры  РГААН.

  Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)- получали растворимый антиген из зоитов саркоцист, выделенных из миокарда теленка, зараженного орально 100 тыс. спороцист S.fusiformis. В колбы объемом 250 мл помещали 30—40 г измельченных содержащих саркоцисты тканей сердца, добавляли 100 мл HCl-пепсин переваривающей жидкости (2,5 г пепсина в пропорции 1:10 000, 10 мл НСl, воды до 1 л) и взбалтывали на магнитной мешалке 5—10 мин при t = 37°C. Супернатант декантировали в 2 центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугировали 5 мин при 500g. Осадок ресуспендировали в растворе Hanksa (рН 7,4; t = 5— 10°С). Суспензию центрифугировали 5 мин при 500g. Белый осадок объемом 0,3 мл, состоящий из уплотненных зоитов S. fusiformis, ресуспендировали в растворе Hanksa, центрифугировали при 500g, супернатант выбрасывали, осадок ресуспендировали в 3 мл физиологического раствора, затем замораживали при t=-20°С. Позже зоиты размораживали, центрифугировали 30 мин при 10000g. Супернатант содержал растворимый антиген (8 мг белка на 1 мл). Для использования в РНГА антиген разбавляли до концентрации 30 мкг протеина на 1 мл солевого фосфатного буфера (PBS) при рН 6,4.

     У зараженных спороцистами S.fusiformis телят титры РИГА повышались на 35—40-й день после инфицирования, достигая значения 1:39000 на 90-й день. У молочных коров титры РИГА изменялись в пределах от 1:486 до 1:540. Титры РИГА 1:54—1:486 могут служить индикаторами субклинического саркоцистоза, титры РИГА от 1:1458 и выше указывают на острый саркоцистоз.

  Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РИФН). Посредством РИФН выявляли циркулирующие антитела у телят, орально инфицированных 250000 спороцист от собак. Титры РИФН изменялись от 1:40 до 1:640 в зависимости от времени, прошедшего после заражения.

  Реакция энзиматических антител (РЭМА) (ELISA). Первоначально РЭМА применяли для серодиагностики токсоплазмоза у человека и животных. Позже приспособили РЭМА для определения циркулирующих антител к пролиферативным стадиям возбудителя саркоцистоза в сыворотках человека и крупного рогатого скота.

     При помощи РЭМА установили, что кросс-реакция между антигеном, полученным из цистозоитов саркоцист, и антигеном, полученным из эндозоитов Toxoplasma gondii, отсутствует. В качестве антигенов ипсользовали водный экстракт саркоцист S.сегпае от мышей (Microtus arvalis) и растворимый токсоплазмозный антиген. Трех морских свинок у которых антитела к пролиферативным стадиям возбудителей саркоцистоза и токсоплазмоза методом РИФН не выявлялись, иммунизировали против S.сегпае или S.cruzi путем внутримышечной инъекции 0,5мг лиофилизированного саркоцистозного антигена. Через 13 дней этим же морским свинкам ввели усиливающую иммунизацию дозу в 0,25 мг антигена. Сыворотки, полученные от иммунизированных таким образом морских свинок, имели положительные титры РЭМА, равные 1:5120, 1:1280 и 1:1280 соответственно. Титры на антиген Toxoplasma gondii были отрицательными.

     Таким образом, для подтверждения диагноза острого саркоцистоза у крупного рогатого скота при вспышках заболевания в естественных условиях, а также при искусственном заражении телят спороцистами S.bovicanis использовали реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию энзиматических антител (РЭМА), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РИФН). В основном серологические реакции применялись для выявления антител при искусственном заражении промежуточных животных спороцистами различных видов Sarcocystis. Главная цель проведенных опытов заключалась   в определении значения титров к антигенам пролиферативных стадий возбудителя саркоцисто-за, по которым можно было бы с уверенностью судить о заражении животных.

     При сравнении результатов серодиагностики и гистологических исследований установлено, что самым высоким титрам серологических реакций соответствуют шизогональяая стадия развития паразита и стадия незрелых саркоцист, проявляющиеся в клинике острого саркоцистоза.

1.8.2. Биохимические и физикохимические

показатели саркоцистозного мяса.

     Саркоцистозное мясо характеризуется низкими органолептическими показателями. Так, суммарное количество аминокислот, свидетельствующее о скорости разложения свинины, увеличивается в зависимости от степени инвазированности (А. А. Богуш, 1974). В белках саркоцистозного мяса увеличивается количество пролина, как следствие нарушения процессов дезаминирования изменяются соотношения некоторых заменимых и незаменимых аминокислот (А. А. Богуш, В. С. Литвяк, Н. А. Урбанович): уровни содержания лецитина, фенилаланина, гистидина, лизина, валина, аргинина увеличиваются в 2,5—4 раза, аланина, метионина, триптофана уменьшаются в 1 5 раза.

     В мясе саркоцистозных животных возрастает содержание свободной воды, снижается количество внутриклеточного жира, протеина и золы, повышается активность протеолитических ферментов. Уменьшается количество фосфора, цинка, йода (А. Г. Какурина, 1976).

 Согласно А. А. Богушу (1976), особенно резко ухудшается качество мяса от зараженных саркоцистами животных при хранении: после 48-часового выдерживания при комнатной температуре такое мясо оказывается непригодным в пищу, тогда как от незараженных животных становится сомнительным по свежести.

     По данным Я.Сентукайте, В.Юкнис, биологическая ценность говядины, пораженной саркоцистами, значительно снижается. Содержание глюкозы уменьшается по сравнению с контролем на 32,8%, гликогена — на 38,6, белка — на 24,5%.

 Содержание гликогена. Процессы распада гликогена, накопления молочной кислоты и снижения рН в основном заканчиваются через 24 ч хранения мяса при t = 4°C.

 Проводилось изучение динамики созревания мяса с определением содержания гликогена в мышцах крупного рогатого скота через 2, 6, 12, 24 и 48 ч после убоя. Накопление гликогена в мышцах животного находилось в обратной зависимости от степени поражения саркоцистами. С усилением саркоцистозной инвазии количество мышечного гликогена уменьшалось до 273± 15,80 мг%.

     В процессе хранения содержание гликогена наиболее интенсивно снижалось в мясе от здоровых животных и от животных, незначительно инвазированных саркоцистами. Через 48 ч содержание гликогена в мясе сильно инвазированных животных уменьшалось только на 164±9,84 мг%, в то время как в мясе здоровых животных — на 404±8,24 мг%.