Фармацевтична промисловість України

 

1.2. Одержання генно-інженерного інсуліну людини

В 1980 р. американськими вченими  Міллером і Бакстером був уперше описаний процес клонування людського  гена в Еscherichia coli з наступною індукцією й одержанням білка, ідентичного людському. Цим білком був інсулін людини.

У промислових умовах рекомбінантний інсулін уперше отриманий американською  фармацевтичною компанією Eli Lilly разом  з біотехнологічною компанією Genentech (США).

Генно-інженерний інсулін виготовляють шляхом ферментації генетично змінених мікроорганізмів (кишкової палички, дріжджів), які здатні синтезувати попередник інсуліну (проінсулін) у складі химерного протеїну. З отриманого біосинтетичним шляхом проміжного продукту ензиматичним шляхом реконструюють інсулін людини.

Дана схема багато в  чому нагадує процес біосинтезу інсуліну в острівцях Лангерганса, де гормон спочатку з'являється у вигляді  білка-попередника (проінсулину), а  потім протеолітичними ферментами від проінсулину відщеплюється  сполучний С-пептид у спеціальних  везикулах. У виробництві для  розщеплення ГБ використають подібні  по специфічності ферменти: трипсин  і карбоксипептидазу Б. Гідроліз проводять шляхом обробки ферментами послідовно або одночасно.

Технологія одержання генно-інженерного інсуліну людини, також заснована на використанні генетично модифікованих дріжджових культур у ролі суперпродуцентів інсуліну людини. Використання еукаріот, що мають подібну з людською систему процессінгу білків, у ролі продуцентів інсуліну дозволило одержати гормон або його попередника в нативній формі. Значною перевагою даної технології є повна відсутність у препараті бактеріальних ендотоксинів і пірогенів клітинної стінки. Незважаючи на всі ці переваги одержання інсуліну з використанням бактеріальних штаммів-суперпродуцентів залишається кращим завдяки більше високому рівню експресії інсуліну в складі гібридного білка.

 

 

РОЗДІЛ 2. ТЕХНОЛОГІЧНА ЧАСТАНА

2.1.Характеристика готової продукції

ІНСУЛІН 100 суспензія для ін'єкцій, 100 МО/мл у флаконах по 10 мл.

Склад на один флакон:

Діючі речовини:  10 мл суспензії містить 1000 МО iнсулiну людського бiосинтетичного, що еквівалентно 34,7 мг.

Допоміжні речовини:  Цинку хлорид (3.2 мг/мл), гліцерин(100 мг/мл), метакрезол (1,5 мг/мл), фенол (0,65 мг/мл), натрію фосфат двозаміщений дигідрат (2,1 мг/мл), протаміну сульфат(10,2), вода для ін'єкцій.

Фармаколгічна дія 

Фармакодинаміка. ІНСУЛІН 100 є суспензією людського інсуліну. Цукрознижувальний ефект інсуліну полягає у сприянні поглинанню глюкози тканинами після зв'язування інсуліну з рецепторами м'язових і жирових клітин, а також в одночасному пригніченні виділення глюкози з печінки.

ІНСУЛІН 100 є інсуліном тривалої дії. У середньому характер дії після підшкірної    ін'єкції такий:

початок дії:                         протягом 1,5 години;

максимальний ефект:        від 4 до 12 годин;

тривалість дії:                    приблизно 24 години.

Фармакокінетика. Період напіввиведення інсуліну з крові становить кілька хвилин. Тому характер дії препарату інсуліну зумовлений виключно характеристиками його абсорбції.  Цей процес залежить від ряду факторів (наприклад, дози інсуліну, способу і місця ін'єкції, товщини підшкірної клітковини, типу діабету), що зумовлює значну варіабельність ефекту препарату інсуліну як в одного, так і в різних хворих.

 

Абсорбція. Пік концентрації у плазмі настає протягом 2-18 годин після підшкірної ін'єкції.

Розподіл. Значного   зв'язування   інсуліну   з   білками   плазми   крові,   за   винятком циркулюючих антитіл до нього (при їхній наявності), виявлено не було.

Метаболізм. Людський   інсулін розщеплюється інсуліновими протеазами чи інсулін-деградуючими ферментами і, можливо, протеїндисульфідизомеразою. Виявлено  ряд ділянок, у яких відбуваються гідроліз молекули людського інсуліну. Жоден із метаболітів, що утворилися після гідролізу, не має біологічної активності.

Елімінація. Тривалість напіввиведення інсуліну визначається швидкістю його всмоктування з підшкірної клітковини. От чому тривалість напіввиведення (tЅ) вказує на швидкість всмоктування, а не елімінації інсуліну з плазми крові (tЅ інсуліну з кровотоку становить всього кілька хвилин). За даними проведених досліджень, tЅ становить                5-10  годин. Можна вважати, що фармакокінетика інсуліну в дітей, підлітків і дорослих практично однакова.

 

 

 

Специфікація на ІНСУЛІН 100

Найменування	Допустимі межі	Метод контролю
Опис	Нейтральна каламутна  біла водна суспензія
Ідентифікація Переглядають хроматограму, одержану у випробувані «Кількісне визначення».    Пептидне картування	На хроматографі випробовуваного  розчину час утримування основного  піка має співпадати із часом утримування  основного піка на хроматограмі розчину  порівняння (а)   Хроматографічний профіль  випробовуваного розчину має  відповідати хроматографічному профілю розчину порівняння	За ДФУ  2.2.2             За ДФУ  2.2.55
Домішки із молекулярною  масою, більшою за молекулярну  масу інсуліну	На хроматограмі випробовуваного  розчину площа піка А2І дезамідоінсудіну людського не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків; сума площ усіх піків, крім піків інсуліну людського  та А21 дезамідоінсудіну людського, не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків. .	За ДФУ  2.2.30
Стерильність	Препарат повинен бути стерильним	За ДФУ 2.6.1
Токсичність	Препарат повинен бути не токсичним	За ДФУ 2.6.9
Пірогенність	Препарат повинен бути апірогенним	За ДФУ 2.6.8
Супровідні білки	На хроматограмі випробовуваного  розчину площа піка А2І дезамідоінсудіну людського не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків; сума площ усіх піків, крім піків інсуліну людського  та А21 дезамідоінсудіну людського, не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків.	За ДФУ 2.2.29
Цинк	Не більше 1.0 %, у перерахунку  на суху речовину	За ДФУ 2.2.23, метод 1
Сульфатна зола	Не більше 2.5 %, у перерахунку  на суху речовину	За ДФУ 2.4.14
Бактеріальні ендотоксини	Менше 10 МО/мг	За ДФУ  2.6.14
Кількісне визначення	Вміст інсуліну людського C257H383N65О77S6 у сумі із А 21 дезамідоінсуліном людським визначають, використовуючи площі відповідних піків на хроматографах випробовуваного розчину та розчину порівняння (а) та зазначений вміст інсуліну людського у сумі із А21 дезамідоінсуліном людським у ФСЗ інсуліну людського	За ДФУ 2.2.2
Зберігання	Зберігати в захищеному від світла місці при температурі від 2°C до 8°C	Згідно  НТД
Термін придатності	2,5 рік	Згідно  НТД

 

 Властивості

Опис. Нейтральна каламутна біла водна суспензія. Визначається візуально.

 

Ідентифікація

А. Переглядають хроматограму, одержану у випробувані «Кількісне визначення».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчину час  утримування основного піка має  співпадати із часом утримування  основного піка на хроматограмі розчину  порівняння.

B. Пептидне  картування (2.2.55).

Селективний розрив пептидних  зв'язків

Випробовуваний розчин. Готують  розчин 2.0 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 М розчині кисіоти хлористоводневої, 500 мкл одержаного розчину переносять у чисту пробірку і додають 2.0 мл HEPES буферного розчину рН 7.5 Р  і 400 мкл розчину І мг/мл протеази Staphylococcus aureus штам VS. тип XV11-B P. Пробірку закривають та інкубують при температурі 25 °С протягом 6 год. Реакцію зупиняють  додаванням 2.9 мл сульфатного буферного  розчину рН 2.0 Р.

Розчин порівняння. Готують  аналогічно випробовуваному розчину, замість випробовуваної субстанції додають ФСЗ  інсуліну лізпро.

Хроматографічне розділення

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Колонка:

— розмір: 0.10 м х 4.6 мм.

— нерухома фаза: силікагель октадецилсилільний для хроматографії      Р (3 мкм) із розміром пop 8 нм.

— температура: 40 °С.

Рухома фаза:

— рухома фаза А: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину  рН 2.0 Р. 700 мл води Р і 100 млацетонітрилу для хроматографії Р: фільтрують і дегазують;

— pyxoмa фаза В: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 400 мл води Р, 400 мл ацетонітрилу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

Таблиця 1.1

Програма хроматографії

Час (хв)	Рухома фаза А (% об/об)	Рухома фаза В (% об/об)
0-60	90→30	10→70
60-65	30	70→ 100
65-70	0	100

 

           Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично  за довжини хвилі 214 нм.

Урівноваження колонки: не менше 15 хв за вихідних умов. Хроматограму холостого  розчину одержують, використовуючи наведений вище градієнт.

Об'єм інжекції: 50 мкл.

Придатність хроматографічної системи:

— хроматоірами випробовуваного  розчину та розчину порівняння мають  співпадати із хроматограмою інсуліну людського, що додається до ФСЗ інсуліну людського,

— на хроматограмі розчину  порівняння ідентифікують піки, що відповідають фрагментам I, II і III:

— коефіцієнт симетрії: не більше 1.5 для піків, що відповідають фрагментам II і III,

— коефіцієнт розділення: не менше 3.4 для піків, що відповідають фрагментам II і III.

Результати: хроматографічний профіль випробовуваного розчину  має відповідати хроматографічному  профілю розчину порівняння.

ПРИМІТКА : час утримування  фрагмента І однаковий для  інсуліну свинячого та для інсуліну людського. Часи утримування фрагментів II і IV однакові для всіх інсулінів. Час  утримування фрагмента III однаковий  для інсуліну бичачого та для інсуліну свинячого.

 

 Випробування

Стерильність. (2.6.1) Випробування проводять, використовуючи метод мембранної фільтрації або метод прямого висівання. Незалежно від методу випробування проводять відповідний негативний контрольний дослід, використовуючи зразки, стерильність яких була доведена раніше. Метод мембранної фільтрації треба використовувати в усіх випадках, коли природа випробовуваного лікарського засобу це дозволяє — для випробування лікарських засобів у вигляді водних розчинів, що піддаються фільтрації; карських засобів, що змішуються або розчиняються у водних розчинниках, або оліях, які не мають антимікробної активності за умов випробування.

Випробування методом  мембранної фільтрації. Використовують мембранні фільтри з номінальним  розміром пор не більше 0.45 мкм, здатні ефективно затримувати мікроорганізми. Для водних, розведених спиртових  розчинів та розчинів в оліях, наприклад, використовують целюлозно-нітратні мембранні фільтри, а для концентрованих спиртових розчинів — целюлозно-ацетатні мембранні фільтри. Якщо необхідно, для деяких лікарських засобів, наприклад, для антибіотиків, можуть бути використані спеціальні мембранні фільтри.

Умови проведення випробування треба регулярно контролювати шляхом аналізу проб, відібраних відповідним  чином у робочій зоні, або проведення інших контрольних заходів, викладених у відповідних Директивах Європейського  Співтовариства і примітках до керівних матеріалів з GMP.

Токсичність. (2.6.9) Випробування проводять на здорових білих мишах масою 19-21г, на яких раніше не проводили ніяких дослідів.

За 24 год. до випробування та під час його проведення тварини  повинні знаходитися в приміщенні з постійною температурою. За 2 год. до зважування та відбору тварин для  проведення випробувань у них  відбирають корм і воду.

Кожну серію препарату  випробовують на 5 мишах. Розчинник, концентрація розчину (тест-доза) та спосіб введення вказані в окремих статтях.

Препарат вважають витримавшим  випробування, якщо протягом передбаченого  терміну спостерігання не загине жодна із піддослідних мишей. У випадку  загибелі однієї миші дослід повторюють на 5 мишах масою 20±0,5 г; у випадку загибелі при початковому випробуванні двох мишей повторне випробування проводять на 15 тваринах. Якщо при повторному випробуванні ні одна миша не загине, тобто сумарна гибель тварин в обох дослідах не перевищить 10%, препарат вважається витримавшим випробування. В противному випадку препарат бракують.

Для випробування на токсичність  відбирають по 2 флакона із кожної серії, що містить не більше 10 000 флаконів. При кількості в серії флаконів більше 10 000 відбирають по 3 флакона  із кожної серії. Для проведення випробування із відібраних флаконів готують загальний розчин (змішана проба). Загальна кількість лікарського засобу повинна бути достатньою для проведення трьох повних випробувань.

Пірогенність. (2.6.8) Випробування проводять на здорових кроликах масою 2-3,5 кг, яких тримали на повноцінному раціоні. Кожний кролик повинен знаходитися в окремій клітці в приміщенні з постійною температурою. Коливання температури не можуть перевищувати±3°С.

Протягом тижня, що передує  досліду, кролики не повинні втрачати масу. Зважування їх проводять до дачі корму не менш ніж 3 рази через день. Тварини, які втрачають масу, до досліду  не придатні. Протягом 3 діб перед  випробуванням у кожного піддослідного  кролика міряють температуру, яка  повинна бути в межах 38,5-39,5°С. тварини з більш високою чи більш низькою температурою для досліду не придатні. Крім того, кроликів, вперше назначених для випробування лікарських засобів, перевіряють на реактивність шляхом внутрішньовенного введення 10мл/кг 0,9 % стерильного непірогенного розчину натрію хлориду, який відповідає вимогам фармакопейної статті. У випадку зміни температури  у кроликів більш ніж на ±0,4°С тварини вважаються непридатними для досліду.

Для дослідження відбирають не менш ніж 2 флакони від кожної серії, що містить від 1 000 до 10 000 флаконів. При кількості в серії флаконів більш ніж 10 000 відбирають по 3 флакони  із кожної серії. Із відібраних флаконів готують загальний розчин (змішана  проба). Від серії, яка містить  до 1 000 флаконів, для випробування відбирають по 1 флакону.