Применение ПААГ-электрофореза для анализа белковых фракций, полученных из культуры Hansenula polymorpha NCYC 495ln

    На  рисунке 2 представлена хроматограмма, на которой отображено изменение показаний УФ и кондуктометрических датчиков. На графике по шкале X откладывается время в минутах, а также отмечается номер пробирки, в которую в данный момент времени отбирается проба. На шкале Y слева откладывается показания УФ датчика – оптическая плотность, а справа – показания кондуктометрического датчика. Можно отметить, что интервалу времени 42 – 64 минуты соответствует пик показаний УФ – датчика – резкое изменение оптической плотности. Наблюдается линейное увеличение показаний кондуктометрического детектора, скачка показаний не происходит, это обусловливается тем, что влияние на электропроводность раствора оказывает только содержание ионов солей. С помощью программного обеспечения, установленного на установке «Biologic LP», можно устанавливать скорость подачи растворов и объём, отбираемый в каждую из пробирок. Зная условия проводимого процесса хроматографии (в данном случае градиент от 60 мМ фосфатного буфера рН=7,6, содержащего 200 мМ KCl, до  1M раствора KCl) можно вычислить интервал концентраций KCl, соответствующий скачку оптической плотности и соответственно десорбции белка. В качестве фракций, содержащих очищенный целевой фермент, отобирали пробирки, которые входили в область скачка оптической плотности на хроматограмме – 9 пробирок, по 2 мл раствора в каждой.

       Собранный фермент концентрировали, используя микроцентрифужные фильтры на 100 КДа на центрифуге при 10000 об/мин, в течение 30 минут. Сконцентрированный фермент представляет собой раствор светло-желтого цвета.

     Степень очистки ферментного препарата от посторонних белков на различных стадиях выделения контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Идентификацию полосы, соответствующей целевому белку осуществляли по коммерческому препарату алкогольоксидазы из Candida boidinii (полоса 6 рис. 9).

     Электрофорез  проводили в следующих условиях:

• Концентрирующий гель - 5% акриламид (рН=8,8)
• Разрешающий гель: 7,5% акриламид (рН=6,8)
• Ток электрофореза: 30 – 80 мА
• Напряжение: 200 - 300 В
• Мощность: 7 – 20 Вт

       Данные представлены на рис.  9.

                1        2        3         4         5        6      

     Рис.9. Электрофореграмма образцов препарата на различных стадиях очистки. 

1 –  бесклеточный экстракт; 2 – после высаливания 30%-ым раствором сульфата аммония; 3 – 60%-ым; 4 – препарат АО после высаливания 60%-ным сульфатом аммония (осадок после центрифугирования); 5-ая ячейка – очищенный препарат АО; 6 – коммерческий препарат алкогольоксидазы из Candida boidinii.

     Интенсивность окраски полос 1, 2, 3 последовательно уменьшается. Это свидетельствует об уменьшении концентрации белка в образцах на каждой из последующих стадий очистки препарата высаливанием сульфатом аммония. После высаливания 60%-ным сульфатом аммония и центрифугирования осадок растворяют в небольшом количестве буфера, что приводит к концентрированию препарата. На электрофореграмме это видно из очень интенсивной окраски полосы 4.

     Как видно из рис. 9, после осаждения 30% и 60%-ным сульфатом аммония (полосы 2, 3 и 4) препарат содержит посторонние белки. После проведения ионообменной хроматографии (полоса 5 рис. 9) была получена фракция препарата без примесей.

    Выводы:

    1.   Из дрожжей рода Hansenula polymorpha NCYC 495ln выделен фермент – алкогольоксидаза и очищен на установке Biologic LP.

    2. Методом электрофореза в ПААГ  проведен анализ белковых фракций, полученных на различных стадиях выделения фермента. Показано, что после очистки методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе получен ферментный препарат АО без примеси посторонних белков.

Список  литературы:

1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. 
   Электрофорез и центрифугирование. – М.: Наука, 1981, 288 с.
2. Ашин В.В. Структурно-функциональные особенности алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia Methanolica, Пущино, 2002.
3. Гильманов А.Ж., Саляхова Р.М. Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа, Уфа, 2011.
4. Э. Галь, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. Электрофорез в разделении биологических макромолекул/ пер. с англ. канд. биол. наук Е.Б. Майзеля и др. / под. ред. В.И. Розенгарта. – М.: Мир, 1982, 446 с.
5. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970; 227: 680-685.
6. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 1987; 166: 368-379.
7. Д. Франфеллер. Физическая биохимия.– Изд. Мир, 1980, 456 с.
8. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. – Минск. Вышэйшая школа, 1976, 288 с.
9. http://www. helicon.ru/
10. Parish C.R., Marchalonis J.J. Anal. Biochem., 34, 436 (1970).
11. Siegel L.M., Menty K.J. Biochim. Biophys. Acta (Amst.), 112, 346 (1966).
12. Waldmann-Meyer H. In. Prot. Biol. Fluids, 16 (Peeters H., ed.), Pergamon, London,            p. 715 (1969).
13. Weber K., Osborn M. J. Biol. Chem., 244, 4406 (1969).
14. Kopperschläger G., Diezel W., Bierwagen B., Hofman E. FEBS Letters, 5, 221 (1969).
15. Ingram L., Tombs M.P., Hurst A. Anal. Biochem., 20, 24 (1967).
16. Anderson L.E., McClure W.O. Anal. Biochem., 51, 173 (1973).
17. Thorun W.Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 9, 3 (1971).
18. Poole T., Leach B.S., Fish W.W., Anal. Biochem., 60, 596 (1974).
19. Waldmann-Meyer H. In. Prot. Biol. Fluids, 16 (Peeters H., ed.), Pergamon, London,            p. 715 (1969).
20. Dunker A.K., Rueckert R.R., J. Biol. Chem., 244, 5074 (1969).
21. Rodbard D., Chrambach A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 65, 970 (1970).
22. Blattler D.P., Anal. Biochem., 27, 73 (1969).
23. Hedrick J.L., Smith A.I. Arch. Biochem. Biophys., 126, 155 (1968).
24. Zwaan J. Anal. Biochem., 21, 155 (1967).
25. Felgenhauer K., Hoppe-Seylers Z., Physiol. Chem., 355, 1281 (1974).
26. Tani Y., Miya T., Nishikawa H., Ogata K. The microbial methabolism of methanol, part I. formation and crystallization of methanol-oxidizing enzyme yeast, Kloeckera sp. 2201 // Agr. Biol. Chem. 1972. V.36. №10. P.68-75.
27. Harder W., Trotsenko Y.A., Bystrykh L.V., Egli T. Methabolic regulation in methylotrophic yeasts. in Proc. 5^th Int. Symp. Microbial growth on C₁ compounds. Eds. Verseveld van H. W., Duine J.A. Martinus Nijhof Publishers Dordrecht. 1987. P.139-149.