Применение ПААГ-электрофореза для анализа белковых фракций, полученных из культуры Hansenula polymorpha NCYC 495ln

      2.3. ПААГ-электрофорез белков

            Основное практическое применение имеет электрофорез в гелях. Гель-электрофорез – электрофорез, в котором смесь заряженных макромолекул разделяется в результате различия в их заряде, размере и скорости миграции через гель (или раствор нейтрального полимера), помещенный в электрическое поле [7].

            В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

           Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномерности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость миграции макромолекул в электрическом поле зависит от температуры. Неравномерность нагревания геля неизбежно приведет к искажению зон и ухудшению их разделения.

           В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми [6]. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой. Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце [1].

        Как уже было сказано выше, для разделения белков обычно используют полиакриламидный гель (ПААГ). ПААГ представляет собой продукт сополимеризации (т.е. смешанной полимеризации в растворе) акриламида и какого-либо сшивающего агента (чаще всего N,N' - метиленбисакриламида). Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трёхмерной сетки. При сополимеризации сначала образуются многочисленные статистические полимерные клубки геля, в которых полиакриламидные цепи неупорядочены и характеризуются максимально возможной энтропией. Эти клубки растут, сближаются, и при условии, что в полиакриламидные цепи встроены полифункциональные соединения типа N,N'-метиленбисакриламида, способные реагировать со свободными функциональными концевыми группами других цепей, между клубками образуются поперечные сшивки.

     Вязкость, эластичность и прочность геля зависят  как от степени полимеризации (т.е. от длины цепей) полиакриламида, так и от степени сшивки (т.е. от количества включившегося N,N’-метиленбисакриламида). На свойства геля влияет также весовое отношение акриламид: бисакриламид. Если оно 10:1, то, гели будут ломкими, твёрдыми и мутными, если же оно превышает 100:1, то гели будут вязкими и очень нестойкими. Эластичные и совершенно прозрачные гели получают при отношении 30:1. Исследование полиакриламидных гелей показало, что размер пор является экспоненциальной функцией от соотношения бисакриламида к общему количеству акриламида, когда выражено на весовой основе. Поскольку кроссшивки образуются случайным образом, размер пор указывается как среднее значение, и индивидуальный размер пор может отличаться в большую или меньшую стороны.

     В качестве катализаторов реакции  сополимеризации, приводящей к образованию ПААГ, обычно применяют окислительно-восстановительные системы, служащие источником свободных радикалов, например:

1. Персульфат аммония – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД);
2. Персульфат аммония – 3-диметиламинопропионитрил;
3. Рибофлавин – ТЕМЕД (действует на свету).

     В отличие от диметиламинопропинитрила и триэтаноламина третичные алифатические амины, такие, как ТЕМЕД, действуют и в малых концентрациях. Персульфат аммония обладает следующими преимуществами: его можно получить в высокоочищенном виде, он относительно устойчив при температурах, близких к 0°С, и практически не выделяет молекулярный кислород. Системы катализаторов, используемые для получения ПААГ, не должны влиять ни на выбранные буферные растворы, ни на электропроводность и вязкость геля [7].

     Полимеризация акриламида инициируется генерированием свободных радикалов. Наиболее распространенным инициатором полимеризации акриламида, выступающим в роли источника свободных радикалов являются персульфат аммония. Механизм полимеризации – радикально-цепной [8].

3. Определение молекулярных масс белков

      Методические  преимущества электрофореза в полиакриламидном геле навели исследователей на мысль  о создании таких его вариантов, которые позволили бы определять молекулярную массу белков [9].

      Для определения молекулярной массы  белка необходимо исключить влияние  заряда молекулы. Для этой цели разработано  множество методов, которые модно  разделить на две группы. В методах  первой группы для определения молекулярной массы используют коэффициент задержки K_r. Для выражения молекулярной массы через K_r предложен целый ряд уравнений [10, 11, 12, 13]. Хедрик и Смит [14] построили графики зависимости коэффициентов задержки, определяемых по кривым Фергюсона, от молекулярной массы белков и обнаружили между ними линейную зависимость (рис. 1)

Рис. 1. Зависимость  между наклоном кривой логарифмов подвижности  и молекулярной массой белков [15].

1 –  димер пепсина; 2 – овальбумин; 3 – α-амилаза; 4 – мономер альбумина; 5 – трансферрин человека; 6 – яичный трансферрин; 7 – гексокиназа; 8 – лактатдегидрогеназа;                                    9 – кетозо-1-фосфат-альдолаза; 10 – β-амилаза; 11 – никотинамидаза; 12 – α-уреаза;                     13 – каталаза; 14 – ксантиноксидаза; 15 – мономер апоферритина; 16 – уреаза;                                  17 – рибулозодифосфат-карбоксилаза. 

     Поскольку коэффициент задержки является функцией размера, а не массы молекулы [16, 17, 18], некоторые белки ведут себя аномально при электрофорезе, если отличаются от большинства других белков по форме молекулы или парциальному удельному объему.

     При электрофорезе в ПААГ, имеющих  различные размеры пор, существует обратная зависимость между подвижностью белков и сопротивлением трения. Поэтому  при наличии калибровочной кривой молекулярные массы белков можно  определять по их относительной подвижности. Между фрикционным отношением и  логарифмом молекулярной массы была обнаружена линейная зависимость (рис. 2) [19, 20].

Рис. 2. Зависимость  между логарифмом молекулярной массы  и отношением абсолютных подвижностей белков при двух разных концентрациях  геля (I – 8 и 5%; II – 10 и 5%) [20].

1 –  овальбумин куриного яйца; 2 –  гемоглобин А человека; 3 – сывороточный альбумин человека; 4 – трансферрин человека; 5 – гаптоглобин человека; 6 – лактатдегидрогеназа человека; 7 – мономер БСА; 8 – димер БСА; 9 – триммер БСА; 10 – тетрмер БСА. 

     Описанные методы имеют то преимущество, что  они позволяют также определять с точностью до 5% молекулярные массы  белков, содержащих дисульфидные связи или состоящие из нескольких субъединиц. Недостаток методов состоит в том, что результаты сильно зависят от конформации белков.

     Для устранения конформационных различий между белками Торан и Мел [19] предложили использовать смесь фенол – уксусная кислота – вода (2:1:1), в которой белки приобретают форму статистического клубка.

     Пул и др. [20] применяли для определения молекулярной массы полипептидов                10%-ный полиакриламидный гель, содержащий 8 М мочевину и 0,9 М уксусную кислоту. Точность определения составила 15%.

     Для определения молекулярной массы  применяют также электрофорез в  гелях с градиентом пористости [10, 21, 22]. Согласно данным Андерсcона и др. [21], при использовании линейного градиента концентрации геля (4 – 26%) в отсутствие мочевины можно определять молекулярные массы белков от 50000 и выше, а в присутствие 8 М мочевины этот предел может быть снижен до 20000.

     Методы  второй группы позволяют снизить  влияние заряда на электрофоретическую  подвижность белков до такой степени, что их миграция в полиакриламидном геле зависит только от размеров молекул.

     В 1966 г. Майзель сообщил о том, что в присутствие анионного детергента ДСН мембраны у белков можно легко солюбилизировать, и разделить путем электрофореза в ПААГ. Позднее Шапиро и др. [11] показали, что подвижность белков, связанных с ДСН зависит от их молекулярной массы. Отношение между расстоянием x, пройденным белком, и его молекулярной массой может быть выражено следующим уравнением:

      Вебер и Осборн [23] обнаружили, что при электрофорезе в 10%-ном ПААГ, содержащим 0,1% ДСН, для белков с молекулярной массой 10000 – 70000 существует линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и электрофоретической подвижностью белков. Для белков молекулярной массой порядка 50000 – 200000 эта зависимость выражается кривой, имеющей слегка гиперболическую форму. Другие авторы [24] применили полиакриламидный гель в концентрациях 5, 10 и 15% для определения молекулярных масс белков равных соответственно 20000 – 350000, 10000 – 100000 и 10000 – 60000 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость  логарифмов молекулярных масс белков от их относительных подвижностей в  ПААГ различных концентраций, содержащих 0,1% ДСН  [24]. А – 5%-ный гель;  Б – 10%-ный гель; В – 15%-ный гель.

1 –  пентамер БСА; 2 – тетрамер БСА; 3 – триммер БСА; 4 – γ-глобулин; 5 – димер БСА; 6 – БСА; 7 – овальбумин; 8 – пепсин; 9 – карбоксипептидаза; 10 – химотрипсиноген А;                   11 – трипсин; 12 – вирус мозаики костра; 13 – β-лактоглобулин; 14 – миоглобин; 15 – белок вируса табачной мозаики; 16 – лизоцим; 17 – β-оксиметиллизоцим; 18 – РНКаза;                            19 – ацетилцистаминил-РНКаза А; 20 – В-цепь химотрипсина; 21 – белок вируса R17; 22 – цитохром С; 23 – С-цепь химотрипсина; 24 – инсулин. 

     В указанных условиях калибровочные  кривые представляют собой прямые линии, за исключением белков м молекулярной массой ниже 20000, которые мигрируют медленнее, чем можно было ожидать, исходя только из их молекулярной массы (рис. 3А). Интересно отметить, что точки, соответствующие подвижности инсулина ( ) при всех концентрациях геля лежат ниже соответствующих калибровочных кривых.

      Вся совокупность методов электрофореза  с применением ДСН получила название SDS-электрофореза. Эта разновидность электрофореза является и в наши дни мощным методом определения молекулярных масс белков [1, 4].

           2.5. Окрашивание белков в ПААГ

     Обнаружение и локализацию белковых зон после  их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски  или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в  них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается  с белками. Процесс диффузии, как  правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого  гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной  трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя  в смеси уксусной кислоты и  метанола или в ТХУ. Одновременно с белками окрашенным оказывается  и сам гель. Это происходит как  за счет простого замещения буфера геля на раствор красителя, так и  в результате некоторой сорбции  его на геле. Однако связывание красителя  с гелем значительно менее  прочно, чем с белками, поэтому  от «фона» удается без особого  труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачиванием его в относительно большом объеме растворителя с несколькими  сменами. Если отмывка идет только за счет диффузии красителя из геля, она  занимает несколько часов, обычно ее ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто в смеси с метанолом, который улучшает растворимость красителя. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37 – 50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опасность ослабления окраски полос [1].

     Если  в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологической  активности, то их локализацию в  геле можно осуществить с помощью  специфической ферментативной реакции  или цепи реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вымачивают в растворе соответствующих субстратов.

     Низкомолекулярные субстраты зачастую диффундируют в  гель быстрее, чем довольно крупные  молекулы красителей, и продолжительность  вымачивания бывает можно сократить. Иногда возникает необходимость  вести наблюдение за миг- 
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную 
смесь белков можно окрасить красителем «Remazol», который ковалентно связывается с белком и мигрирует вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в 
присутствии ДСН, в щелочной среде.