Применение ПААГ-электрофореза для анализа белковых фракций, полученных из культуры Hansenula polymorpha NCYC 495ln

4. Индукция дрожжей на метаноле.

            Отценрифугированная биомасса помещается в колбу с 200 мл бесфосфатной среды и индуцируют 2 мл метанола, затем колбу ставят в шейкер инкубатор на сутки (Т=28⁰С).

Полученную индуцированную биомассу центрифугируют при 8000g в течение 30 мин.

 

4.2. Методика выделения фермента.

Технологическая схема методики

      ТП-1

      ТП-2

      ТП-3

      ТП-4

       ТП-5

 

Таблица.4. Описание схемы методики.

 

          ТП-1. Разрушение клеток.

    К дрожжевой биомассе добавляют 15 мл калий фосфатного буфера (60 мМ, pH=7,5),  затем при t=20^oC разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе.

    ТП-2. Центрифугирование (удаление нерастворимой  фракции биомассы).

    Получение супернатанта осаждением и последующим удалением нерастворимой фракции дрожжевой биомассы путём центрифуширования на 8000 g в течение 30 мин.

    ТП-3. Высаливание бесклеточного экстракта.

    К супернатанту при постоянном перемешивании добавляют кристаллический сульфат аммония до концентрации 30% от насыщения (17,6г на 100мл [8]). Суспензию центрифугируют на 10000 g, удаляют осадок, затем доводят концентрацию сульфата аммония в супернатанте до 60% (19,5г на 100мл) и непрерывно перемешивают 30 мин. Суспензию вновь центрифугируют при тех же условиях, сохраняют супернатант для дальнейших стадий.

    ТП-4. Хроматография на ДЭАЭ-сефарозе.

    Т.к. после высаливания получившаяся паста помимо белков содержит сульфат аммония, препарат АО следует растворить в таком объёме буфера, чтобы ионная сила раствора не мешала сорбции белков на ДЭАЭ-сафарозе. Раствор готовят так, чтобы на 1 г белковой пасты на 75 мл фосфатного буфера (60 мМ, pH=7,5), затем его центрифугируют на 13400 g 30 мин и наносят на колонку, заполненную ДЭАЭ-сефарозой, перистальтическим насосом со скоростью 1 мл/мин так, чтобы на 1 г суммарного белка приходилось 60 мл набухшей сефарозы. Предварительно колонку уравновешивают калий фосфатным буфером (60 мМ, pH=7,5). После полного переноса препарата АО колонку промывают калий фосфатным буфером (200мМ, pH=7,5) до исчезновения каталазной активности. Для десорбции препарата колонку промывают градиентом (0 – 50%) 1М KCl в 60мМ калий фосфатном буфере (pH 7,5), при этом наблюдается пик показаний датчика УФ в диапазоне 50-80% 1М КCl. Очистку осуществляли на хроматографической установке Biologic LP.

    ТП-5. Концентрирование АО.

    Чтобы максимально сократить объём  раствора белков, проводят концентрирование препарата АО, получая предел её растворимости. Это дополнительное концентрирование проводят в концентрирующих центриконах на центрифуге при 10000 g 15 мин. 
 

 
 
 
 
 

4.3. Методика проведения электрофореза.

Реагенты:

1. Трис (трис(гидроксиметил)аминометан, далее tris-base)
2. Трис-гидрохлорид (далее tris-HCl)
3. Акриламид (далее AA)
4. Бисакриламид (далее BIS)
5. Персульфат аммония (далее PSA)
6. Тетраметилэтилендиамин (далее TEMED)
7. 95% этанол
8. Ледяная уксусная кислота
9. 5% пероксид водорода
10. Дистиллированная вода
11. Бромфеноловый синий

Объекты исследования:

     . Фермент – алкогольоксидаза.

4.3.1. Приготовление рабочих растворов.

1. 1М Tris-Cl (pH 6,8)

1,23 г tris-HCl и 5,13 г tris-base растворить в колбе на 50 мл и довести до метки дистиллированной водой.

2. 1M Tris-Cl (pH 8,8)

7,28 г tris-HCl и 0,47 г tris-base растворить в колбе на 50 мл и довести до метки дистиллированной водой.

3. 30% акриламид (АА)

Таблица 3. Приготовление 30%-ного акриламида

 

4. 10% PSA

• 0,1 г персульфата аммония

• 900 мл воды

5. Раствор для проявления  (1) при окрашивании кумасси G-250

• 80 мл этанола
• 14 мл ледяной уксусной кислоты
• 106 мл воды

6. Раствор для проявления (2) при окрашивании кумасси G-250

• 10 мл этанола
• 14 мл ледяной уксусной кислоты
• 176 мл воды

!Все  растворы хранить  не более 1 месяца  при +4⁰С! 

     Приготовление растворов для  электрофореза белков

1. Разрешающий гель

Таблица 4. Приготовление 10 мл разрешающего геля различной концентрации АА

 

2. Концентрирующий гель

      Таблица 5. Приготовление 5%-ного концентрирующего геля

 

3. 1Х   трис-глициновый электродный буфер (pH = 8,8)

Смешивали 3,10 г tris-base с 19,3 г глицина и растворить в 1л воды.

4. 4Х буфер для образцов

Таблица 6. Приготовление 10 мл буфера для образцов

 
 

4.3.2. Подготовка установки к работе.

Электрофоретическая установка

Рис. 7. Камера для вертикального электрофореза VE – 2M от фирмы Helicon (Москва) с размером стекол слэба (кассеты) 150x122 мм² (есть возможность одновременного установления двух слэбов).

1. Слэб
2. Нижняя ячейка
3. Зажимы
4. Спейсеры
5. Верхняя ячейка
6. Источник питания “Эльф-4”.

 

      1. Верхнюю камеру устанавливали  на ровную горизонтальную поверхность. Слэб из стекол с вырезом и без выреза со вставленными вдоль его кромок спейсерами (фторопластовые пластинки) выравнивали по основанию ячейки и по боковым граням, затем прижимали зажимами. Стекло с вырезом при этом находилось с внутренней (обращённой в верхний буфер) стороны слэба. Затем, если не было необходимости использования двух гелей одновременно, вместо второго слэба ставили заглушку из оргстекла.

     2. После этого проводили герметизацию  слэбов при помощи расплавленного 2%-ного раствора агарозы вдоль кромок и нижнего торца слэба. Для этого удобно пользоваться пастеровской пипеткой и заливочным столиком.

     3. Вставляли верхнюю ячейку в нижнюю, отмечали фломастером уровень, отстоящий от верхнего торца слэба на 2,5 – 3 см (верхний уровень разрешающего геля). Затем заливали свежеприготовленный 7,5% разрешающий гель до метки (акриламид полимеризуется за 5 – 10 мин), сверху наслаивали ~200 мкл воды (для определения времени конца полимеризации полезно оставить немного раствора акриламида в пробирке).

   4. Удалив наслоенную воду шприцем, до конца заполняли слэб концентрирующим гелем, вставляли гребенку и ждали времени конца полимеризации.

 

5. Обсуждение результатов.

    Клетки  метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495ln были выращены по стандартной методике на богатой среде. В качестве ростового субстрата на начальном этапе роста использовался глицерин. Собранная биомасса представляла собой суспензию светло желтого цвета, без посторонних включений, с характерным дрожжевым запахом.

    Дрожжевые клетки были разрушены на ультразвуковом дезинтеграторе. В результате получили гомогенат биомассы бледно-желтого цвета. Следующим этапом была экстракция водорастворимых белков смешиванием гомогената биомассы с равным объемом 60 мМ калий фосфатного буфера, содержащего 200 мМ КCl, pH 7.5. Полученную суспензию центрифугировали, с целью получения бесклеточного экстракта (супернатанта).

    Полученный супернатант ступенчато фракционировали сульфатом аммония. После первого высаливания для дальнейшей работы отбирали супернатант, осадок удаляли. При втором высаливании (60% от насыщенного содержания сульфата аммония) белковую суспензию осаждают центрифугированием, и использует на последующих стадиях. Супернатант, отделённый на этой стадии содержит следовые количества целевого фермента – алкогольоксидазы (на основании данных электрофореза), и в дальнейшем не используется.

    Очистку методом ионообменной хроматографии осуществляли на хроматографической установке Biologic LP. В качестве носителя использовалась ДЭАЭ-сефарозу (BIO-RAD). Белок наносили на колонку в 60 мМ фосфатном буфере рН=7,6, содержащем 200 мМ KCl.

    

    Рис 8.  Зависимость показаний уф и  кондуктометрических датчиков от времени  протекания в  процессе хроматографии.