Применение ПААГ-электрофореза для анализа белковых фракций, полученных из культуры Hansenula polymorpha NCYC 495ln

Содержание.

Введение………………………………………………………………………………………..2

2.  Литературный обзор………………………………………………………………………3

  2.1. Общие принципы электрофореза……………………………………………………..3

  2.2. Электрофорез белков…………………………………………………………………..4

  2.2.1. Поведение  белков при электрофорезе………………………………………………4

3. ПААГ-электрофорез белков………………………………………………………...…7
4. Определение молекулярной массы белков…………………………………………...9
5. Окрашивание белков в ПААГ………………………………………………………..12
1. Кислые красители………………………………………………………………13
2. Другие красители и методы окрашивания……………………………………16
3. Алкогольоксидаза и её биохимические свойства……………………………………17

3.1. Роль АО  в метилотрофном метаболизме дрожжей………………………………...17

4. Экспериментальная часть……………………………………………………………….18

  4.1. Методика выращивания дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495ln ……………18

  4.2. Методика выделения фермента………………………………………………………..20

  4.3. Методика проведения электрофореза………………………………………………....22

        4.3.1. Подготовка растворов……………………………………………………………23

        4.3.2. Подготовка установки к работе………………………………………………….25

5. Обсуждение результатов………………………………………………………………….27

Выводы…………………………………………………………………………………………30

Список  литературы…………………………………………………………………………..31 
 
 
 
 

Введение.

      Электрофорез  – это перемещение заряженных частиц в растворе (в зависимости  от знака их суммарного электрического заряда) к аноду или катоду под  действием электрического поля. Поскольку  скорость движения молекул в электрическом  поле зависит от их заряда, формы  и размера, то электрофорез может  быть использован для их разделения [1].

     Электрофорез был открыт Ф.Ф. Рейссом в 1807 и считается  одним из важнейших разновидностей электрокинетических явлений. Электрофорез используют в электрохимии для изучения двойного электрического слоя, адсорбции ионов на поверхности, в медицине. В промышленности электрофорез  используют для выделения каучука из латекса, очистки воды, отделения каолина от песка и др. В биохимии электрофорез служит для анализа, разделения и очистки биополимеров (главным образом белков), бактериальных клеток, вирусов, а также аминокислот, витаминов и др. Практическое применение электрофореза началось после создания шведским учёным А. Тиселиусом специального аппарата для фронтального (или свободного) электрофореза белков в растворе (1937). За 70 лет существования этого метода было создано огромное количество его разновидностей. Одним из важнейших видов этого метода является вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофорез), применяемый для анализа, разделения и очистки белков. Существуют две его основные разновидности:  SDS-электрофорез и нативный электрофорез.

     ПААГ-электрофорез без применения додецилсульфоната натрия используют в том случае, если необходимо сохранить нативную структуру белка. Таким образом, можно идентифицировать на электрофореграмме различные белки-ферменты по специфическим реакциям, катализируемым ими. Так, например, разделение белков методом нативного электрофореза используют для изучения экспрессии алкогольоксигеназ дрожжевых клеток в различных условиях их культивирования [2]. Однако электрофорез в этом случае проводят только после предварительного разделения и концентрирования суммарных белков другими методами (гель-фильтрация и др.).

     Целью настоящей работы является получение препарата АО из белковых фракций и применение ПААГ-электрофореза для её определения на различных стадиях выделения фермента из дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495ln методом электрофореза в полиакриламидном геле в нативных условиях. 
 

      2. Литературный обзор

      2.1. Общие принципы электрофореза

      Электрофорез  занимает сейчас центральное место  среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности [1].

      Наиболее  часто используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применялся во многих лабораториях, однако он имеет много недостатков. Основной из них – в том, что результаты фракционирования белков этим методом могут быть получены лишь на 2-3 день исследования. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций (до 30), но и ему присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин. Использование мембран из ацетата целлюлозы позволяет достигнуть компромисса и использовать их главные особенности - однородность материала, очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0,4–2,0 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20-80 мин), легкость отмывания фона, а также относительно низкую стоимость пленок и их доступность. В целом применение ацетатцеллюлозных мембран позволяет повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, требуемое для разделения, окраски и анализа [3].

      Физический  принцип метода заключается в  следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым  суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят  от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например, стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают

разные  скорости [1].

    Постепенно  исходный препарат, состоявший из различных  молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул мигрирующих с одной  и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя избежать конвекции, которая  деформирует и смешивает разделяющиеся  зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной среде. Наличие  сетки геля приводит к тому, что  теперь фракционируемые макромолекулы  сталкиваются с нитями полимера, образующего  сетку геля, что увеличивает эффективное  трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных молекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров [4].

      2.2. Электрофорез белков

           2.2.1. Поведение белков при электрофорезе

           Биологически активные формы белков часто состоят из нескольких идентичных или различающихся полипептидных цепей. Обычно полипептидные цепи удерживаются между собой водородными или дисульфидными связями. Хотя в основном поведение белков при электрофорезе определяется их аминокислотным составом, во многих электрофоретических процессах важную роль играют также третичная и четвертичная структура белка. Дело в том, что изменение конформации молекулы может вызвать изменение ее размеров, а это имеет существенное значение, когда при электрофорезе в качестве дополнительного фактора разделения используется эффект молекулярного сита.

      Изменения молекулярной структуры разделяемых  белков могут привести к их необратимой инактивации. Этот фактор обязательно нужно учитывать при проведении электрофореза с целью выделения активных веществ или изучения ферментов. Поэтому для предотвращения денатурации следует подбирать такую буферную систему, которая обеспечивала бы минимальное нагревание белка, а также его минимальное окисление или восстановление (нативный электрофорез) [4].

      С другой стороны, в результате денатурации  белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое  разделение. Этот факт используется в  методе SDS-электрофореза [1, 4], в котором производят предварительное восстановление белков и их комплексирование с додецилсульфонатм натрия (ДСН).

      Это один из наиболее популярных методов – электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия (ДСН), который позволяет фракционировать белки в зависимости от значения только одного параметра – их молекулярной массы. Основной принцип метода – снижение влияния заряда макромолекулы на ее электрофоретическую подвижность. В этом случае должна наблюдаться пропорциональность между молекулярной массой макромолекулы и ее сопротивлением трения (коэффициентом задержки). Для этого белки обрабатывают избытком ДСН, который примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДСН с 1 мг белка. Избыток остатков сульфокислоты делает несущественным собственный заряд белка, а постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к массе для любого белка. Кроме того, при обработке белка ДСН полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения, размер большой оси вращения которого линейно связан с числом аминокислот. Наиболее широко используемым вариантом электрофореза с добавлением ДСН является диск-электрофорез по Лэммли [5]. Этот метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых белков за счет введения дополнительного так называемого «формирующего» крупнопористого геля, в котором белки не фракционируются, а только концентрируются в виде очень узких полос перед переходом в разделяющий гель. Система Лэммли позволяет хорошо разделять белки с Mr = 15-200 кДа. Для анализа низкомолекулярных белков и пептидов наиболее широко используется система предложенная Шаггером [6].

    С точки зрения электрофореза наиболее важное значение имеют свойства белков, связанные с их ионизацией. Из-за разнообразия и различного количества определенных функциональных групп, отвечающих за ионизацию, разные белки имеют различный заряд при определенном значении pH. Поэтому при разделении смеси белков очень важно знать зависимость электрофоретической подвижности от pH для каждого компонента, особенно в тех случаях, когда требуется выбрать такое значение pH, при котором электрофоретические подвижности компонентов различаются наиболее сильно. Это значение pH было бы идеальным для разделения. Так как лишь в редких случаях зависимость электрофоретической подвижности от pH известна для всех компонентов смеси, приходится подбирать наиболее подходящее значение pH эмпирическим путем [1,6].

     Итак, электрофоретическая подвижность  белковых молекул зависит от многих факторов [7, 8]:

1. Заряд – подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда частицы. Величина заряда частицы-макромолекулы зависит от рН раствора.
2. Размер – чем крупнее частица, тем меньше ее подвижность. Это 
   связано с возрастанием сил трения и электростатических сил 
   взаимодействия молекул с окружающей средой.
3. Форма – молекулы одинакового размера, но различные по форме.
4. Электрическое поле – скорость движения пропорциональна силе 
   тока. Путь, пройденный ионами пропорционален времени пропускания 
   тока.
5. Сопротивление – скорость миграции обратно пропорциональна 
   сопротивлению, а сопротивление зависит от типа и размеров носителя 
   и от ионной силы буфера. Сопротивление возрастает с увеличением 
   длины слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а так 
   же с увеличением концентрации буферных растворов.
6. Буфер – он создает и стабилизирует рН носителя, а также влияет 
   на скорость миграции частиц.
7. Концентрация буфера – по мере увеличения ионной силы буфера 
   компонент   тока,   обусловленный   переносом   ионов   буфера,  будет 
   возрастать,   а  доля, приходящаяся  на ток  за счет ионов   образца 
   уменьшается, значит, скорость миграции образца уменьшается. При 
   высокой   ионной   силе   буфера   суммарный   ток   увеличивается,   а 
   следовательно возрастает и количество выделяемого тепла. При низкой ионной силе буфере ток обусловленный переносом ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца – возрастает. Т.е. миграция образца ускоряется. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшается, но возрастает диффузия. Вследствие чего разделяющая способность хуже, чем при высокой ионной силе. Следовательно, при выборе ионной силы приходиться идти на компромисс. Интервал ионных сил от 0,05 до 0.1 М.
8. рН: с ростом рН степень ионизации органических кислот возрастает, а оснований – уменьшается. Следовательно, меняется их электростатическая подвижность.