Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

 

2.7. В жидкостной хроматографии широко применяют ЭВМ, измеряющие площади пиков. Они выводят на печать полное сообщение, включая название веществ, площади пиков, времена удерживания, поправочные коэффициенты на отклик детектора и содержание (в масс.%) для различных компонентов образца.

 

3. расчет количественного состава смеси на основании хроматографических данных (методы калибровки):

 

3.1. Метод внешнего стандарта (абсолютной калибровки). Вводят в хроматограф

определенный объем каждого стандартного раствора и измеряют площадь или высоту пика. Для каждого вещества строят график зависимости высоты или площади пика от концентрации или массы.

При анализе микропримесей желательно хроматографировать контрольные образцы, не содержащие интересующих компонентов. Основной источник погрешностей такой калибровки, введение образца. Точность

анализа значительно повышается при использовании петлевых дозаторов.

 

3.2. метод нормировки - метод калибровки по размерам пиков, широко применяемый в ГЖХ, обычно реже используют в ВЭЖХ. Метод основан на измерении площади или высоты каждого пика в хроматограмме и вычислении содержания (в %) каждого компонента, пропорционального суммарной площади или высоте. Содержание всех компонентов принимают равным 100%. В жидкостной хроматографии такой подход используют после определения поправочных коэффициентов на отклик детектора для каждого вещества и после умножения площади пика на соответствующий коэффициент, чтобы учитывать различные значения для каждого компонента смеси. Цифровые интеграторы и ЭВМ обсчитывают пики на хроматограмме по принципу нормировки. В память интегратора можно вводить коррекцию на нелинейность детектора по отношению к каждому компоненту. Метод нормировки применим и в том случае, когда надо количественно определить все компоненты смеси, что затруднительно при использовании метода абсолютной калибровки.

 

3.3. Метод внутреннего стандарта. Этот метод известен также под названием

относительной или косвенной калибровки. Метод основан на добавлении внутреннего стандарта вещества с известной концентрацией, не присутствующего в первоначальной смеси, в неизвестный образец для получения отдельного пика на хроматограмме и компенсации различных аналитических ошибок. Таким образом, известное вещество играет роль внутреннего маркера и компенсирует небольшие отклонения параметров разделения на размер пиков. При хроматографировании специально приготовленных смесей с известным массовым соотношением анализируемого вещества и стандарта минимальная погрешность метода составляет 0,1%.

При использовании метода возможно исключение аппаратурных и методических

погрешностей. Добавление внутреннего стандарта до ввода пробы в колонку позволяет скомпенсировать погрешности, связанные с подготовкой пробы к анализу или получением производных интересующих соединений. Однако погрешность метода внутреннего стандарта выше, чем метода внешнего стандарта, так как измеряют размеры двух пиков (отношение пиков), а не одного.

Внутренний стандарт должен быть химически инертным, полностью отделяться от других компонентов смеси, концентрация его должна быть близка к концентрации

определяемых веществ. Внутренний стандарт должен быть по возможности аналогичен по структуре определяемым веществам. При таком подходе потеря интересующего соединения будет сопровождаться потерей эквивалентной части стандарта.

Калибровку с использованием внутреннего стандарта проводят при хроматографировании смесей, содержащих внутренний стандарт в постоянной концентрации, а интересующий компонент в разных концентрациях. Измерив площади или высоты определяемых соединений, строят график отношений их к площади или высоте внутреннего стандарта в зависимости от концентрации интересующего компонента. При правильной калибровке график линеен и проходит через начало координат.

 

 

4. интерпретация полученных результатов, т. е. статистическая обработка.

Количественные измерения характеризуются точностью и воспроизводимостью результатов. Точность характеризуется разностью (погрешностью) между истинной и измеренной величинами. Погрешности бывают детерминированные (систематические) и случайные (недетерминированные). Систематические погрешности можно учесть, и вводя поправочные коэффициенты, увеличить точность анализа. В ВЭЖХ систематические погрешности получают при взятии неправильной пробы, перекрывании пиков, нелинейности детектора или различной чувствительности его к разным веществам, при расчетах, и вообще при работе оператора, что связано с индивидуальными особенностями исследователя. Небольшие систематические погрешности позволяют иметь высокую точность анализа. Недетерминированные погрешности случайны, присущи лишь данному методу анализа. Их можно уменьшить, но нельзя исключить. Можно достигнуть высокой воспроизводимости при небольших случайных погрешностях, распределение которых обычно соответствует кривой нормального распределения вероятностей. Мерой воспроизводимости результатов является стандартное или среднее квадратическое отклонение.

Стандартное отклонение S характеризует воспроизводимость и позволяет оценить дисперсию и доверительный интервал. Его определяют по формуле:

 

где, - результат отдельного измерения; - арифметическое всех взмерений;

N - число измерений.

Относительную стандартную погрешность или относительное стандартное

отклонение С вычисляют по формуле

С = (S/X)100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Примеры применения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе.

Вэжх-анализ амброксола

            Компоненты: 
       1. Сахарин  
       2. Амброксол  
        3. Ванилин  
        4. Бензойная кислота  

Колонка: Synergi Max-RP 250х4.6 мм 4 мкм 
Подвижная фаза: 10 ммоль р-р пентилсульфоната натрия в воде / ацетонитрил (70:30) 
Расход: 0,9 мл/мин 
Температура колонки: комнатная 
Объем пробы: 20 мкл 
Детектор: Спектрофотометрический 
Параметры детектирования: длина волны 254 нм 
Образец: «Амброксол» сироп 15мг/5мл

Вэжх-анализ бромгексина

                 Компоненты:

1. Сахарин 

                 2. Ванилин  
                 3. Бромгексин  
                 4. Бензоат натрия  
 
Колонка: Synergi Max-RP 250х4.6 мм 4 мкм 
Подвижная фаза: 10 ммоль р-р пентилсульфоната натрия в дистиллированной воде / ацетонитрил (57:43) 
Расход: 0.9 мл/мин 
Температура колонки: комнатная 
Объем пробы: 20 мкл 
Детектор: Спектрофотометрический 
Параметры детектирования: длина волны 232 нм 
Образец: «Бромгексин» сироп 8 мг/5 мл

Вэжх-анализ кетотифена

Компоненты:

1. Фумаровая кислота 

2. Кетотифен         3. Метилпарагидроксибензоат  
 
Колонка: Synergi Max-RP 250х4.6 мм 4 мкм 
Подвижная фаза: 10 ммоль р-р пентилсульфоната натрия в дистиллированной воде / ацетонитрил (60:40) 
Расход: 0,8 мл/мин 
Температура колонки: комнатная 
Объем пробы: 20 мкл 
Детектор: Спектрофотометрический 
Параметры детектирования: длина волны 232 нм 
Образец: «Кетотифен» сироп 1 мг/5 мл

Вэжх-анализ ибупрофена

Компоненты: 
1. Метилпарагидроксибензоат  
2. Пропилпарагидроксибензоат  
3. Ибупрофен  
 
Колонка: Synergi Max-RP 250х4.6 мм 4 мкм 
Подвижная фаза: 1% р-р фосфорной кислоты в дистиллированной воде / ацетонитрил (35:65) 
Расход: 0,9 мл/мин 
Температура колонки: комнатная 
Объем пробы: 20 мкл 
Детектор: Спектрофотометрический 
Параметры детектирования: длина волны 232 нм 
Образец: «Ибупрофен» суспензия 100 мг/5 мл

Вэжх-анализ лоратодина

Компоненты:

              1. Ванилин  
              2. Лоратадин  
 
Колонка: Synergi Max-RP 250х4.6 мм 4 мкм 
Подвижная фаза: 10 ммоль р-р фосфата аммония трехзамещенного трехводного (рН 8,5-8,7) в дистиллированной воде / ацетонитрил (40:60) 
Расход: 1,2 мл/мин 
Температура колонки: 50 °С 
Объем пробы: 20 мкл 
Детектор: Спектрофотометрический 
Параметры детектирования: длина волны 254 нм 
Образец: «Лоратадин» сироп 5 мг/5 мл

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выводы

До настоящего времени метод ВЭЖХ активно развивался в направлениях повышения автоматизации (вытеснения человека) и управляемости, а также в соответствии с законом перехода в надсистему. В направлении повышения управляемости ВЭЖХ системы прошли путь от неуправляемых систем до систем с внешним управлением. Современные системы комплектуются насосами с регулируемой скоростью потока и детекторами, позволяющими работать в широком интервале длин волн. Автоматизация ВЭЖХ систем также достигла значительных успехов: комплектация автосемплерами и селекторами колонок, управляемыми с помощью специальных компьютерных программ, значительно уменьшает степень вовлеченности человека в процесс. Данный метод и дальше будет развиваться, становится более автоматизированным, быстрым и безопасным.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1. Сычев С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография / С.Н.Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. – Орел: ОрелГТУ, 2002. – 134 с.
2. Стыскин Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. – М.: 1986. – 284 с.
3. Шатц В.Д., Сахартова О.В. высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. – Рига: Зинатне. – 1988. – 390 с.
4. http://lin.irk.ru
5. http://ru.wikipedia.org
6. http://www.lumex.ru/
7. http://www.metodolog.ru
8. http://www.prochrom.ru