Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

 

 

 

 

 

 

 

Курсовая работа

на тему

Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Исполнитель: Ермакова Елена Александровна

студентка 52 группы

Руководитель: Ендальцева Ольга Сергеевна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пермь 2012

Оглавление

Оглавление ---------------------------------------------------------------------------------2

Введение ------------------------------------------------------------------------------------3

Обзор литературных данных

1. ВЭЖХ определения, достоинства, недостатки -----------------------------4
2. Строение и принцип действия жидкостного хроматографа -------------4
3. Сорбенты, применяемые в ВЭЖХ --------------------------------------------5
4. Подвижная фаза для ВЭЖХ ----------------------------------------------------6
5. Классификация методов ВЭЖХ -----------------------------------------------6
6. Качественный анализ -----------------------------------------------------------10
7. Количественный анализ --------------------------------------------------------11
8. Примеры привенения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе ------------17
9. Выводы -----------------------------------------------------------------------------20
10. Список литературы --------------------------------------------------------------21

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Методы анализа, применяемые в фармакопейном анализе (титриметрические, спектрофотометрические), можно использовать только для анализа индивидуальных веществ или простейших смесей. Определение в одной пробе 2 – 3 соединений такими методами возможно только в очень редких случаях, когда свойства соединений очень отличаются друг от друга. Для применения сложных смесей предпочтительнее использовать хроматографические методы, так как в одной пробе происходит разделение смеси веществ и их анализ.

Сегодня ВЭЖХ применяют во многих областях науки и техники, в том числе и в фармацевтической промышленности. ВЭЖХ вытесняет классическую колоночную, бумажную и тонкослойную хроматографии. Важнейшими катализаторами развития хроматографической науки и практики являются потребности разных естественных и технических наук, начиная от медицины и кончая креминалистикой, а также химические и биологические науки Рост применения связан с разработкой теоретических основ и серийным выпуском отдельных узлов и аппаратов для ВЭЖХ, а так же растворителей и химикатов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обзор литературных данных

 

1. ВЭЖХ определение, достоинства и недостатки.

Хроматография – это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна (сорбент), а другая подвижна (жидкость).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (3 – 5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа 3 – 30 мин). Использование высокоселективных детекторов позволяет определить в сложных смесях микроколичества веществ.

Важнейшим преимуществом ВЭЖХ перед газовой хроматографией – это возможность исследовать практически любые объекты без ограничений по их физико-химическим свойствам (например, температура кипения, молекулярная масса).

Недостатком является дороговизна оборудования.

 

2. Строение и принцип действия жидкостного хроматографа.

В любом жидкостном хроматографе есть следующие части: 1 – насос, 2 – узел ввода пробы, 3 – хроматографическая колонка, 4 – детектор, 5 – регистратор (самописец, интегратор, компьютер), 6 – термостат колонок, 7 – узел подготовки элюента с емкостями для элюента, 8 – слив элюента или коллектор фракций.

Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой смеси с помощью узла ввода пробы вводятся в верхнюю часть хроматографической колонки. С помощью насоса анализируемая смесь прокачивается элюентом (подвижная фаза) через хроматографическую колонку, которая представляет собой трубку, содержащую сорбент. В колонке происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий отдельные компаненты анализируемой смеси детектируется детектором, показания которого регистрируются регистратором.

 

 

 

3. Сорбенты, применяемые в ВЭЖХ.

Основными группами сорбентов являются:

• поверхностно-пористые сорбенты, представляющие собой непроницаемое для растворителя ядро из стекла, на поверхность которого нанесен тонкий слой пористого сорбента, обычно силикагеля. Достоинства: возможность упаковки в колонки сухим способом, легкость фракционирования, широкий ассортимент привитых и нанесенных фаз.

Недостатки: малая поверхность сорбента в колонке (основной объем занимает непористое ядро, которое не участвует в разделении), большое гидравлическое сопротивление длинных колонок, малая производительность, быстрая перегрузка, сложная технология получения сорбентов и их дороговизна, длительность анализа и недостаточная эффективность

• пористые сорбенты на основе силикагеля. В настоящее время фирмы производят более 200 сорбентов для ВЭЖХ на основе силикагеля. На поверхности силикогеля находятся свободная силанольная, силанольная, связанная водородной связью, силоксановая группы.
• пористые сорбенты на основе оксида алюминия. Для хроматографии используется гамма-оксид алюминия. В ВЭЖХ носит ограниченный характер,в тех случаях когда требуется селективность, отличная от силикагеля.
• пористые сорбенты на полимерной основе, чаще применяются в распределительной ВЭЖХ. Достоинства: неограниченный рабочий диапазон рН
• гели, применяются в эксклюзионной ВЭЖХ. Они подразделяются на две группы: полужесткие (органические) и жесткие (неорганические, аэрогели). Органические гели представляют собой сшитые сополимеры с большой плотностью сшивки, способные ограничено набухать в используемых растворителях.

В качестве жестких неорганических сорбентов применяется силикагели, в меньшей степени пористые стекла.

• сорбенты для ионообменной хроматографии можно разделить на ионообменные смолы, силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами.

 

 

 

4. Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Растворители, применяемые в ВЭЖХ, должны удовлетворять требованиям:

• чистота, влияет на все основные стадии процесса: подачу растворителя, разделение в колонке, детектирование и воспроизводимость результатов;
• химическая инертность, при использование химически активных растворителей ухудшает детектирование, портят сорбенты, изменять компоненты пробы и вызывать коррозию аппаратуры;
• совместимость с детектором;
• достаточная растворяющая способность по отношению к анализируемым веществам;
• низкая вязкость, чтобы не ухудшать массопередачу, и не затруднять работу насоса;
• безопасность, необходимы определенные условия в помещениях (эффективная приточно-вытяжная вентиляция, недопущение на рабочем месте застойных зон) и использовать менее токсичные и взрывоопасные растворители;
• доступность

В некоторых случаях значение имеет смешиваемость с другими растворителями, температура кипения и возможность легкого извлечения вещества из элюента.

 

5. Классификация методов ВЭЖХ.

 

1. По механизму разделения анализируемых веществ ВЭЖХ:

• Адсорбционная хроматография.

Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, имеющими на поверхности активные центры (например, силикагель, оксид алюминия). Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (способными поляризоваться) группами или участками молекул (например, диполь-дипольное взаимодействие, образование водородной связи, образование комплексов с переносом заряда).

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикогеля с разной поверхностью, объемом и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко – другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого – недостаточная механическая прочность адсорбентов, не позволяющая упаковывать их и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

 Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителей для этих адсорбентов одинаков. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селективности, тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. Например, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

К недостаткам адсорбционной ВЭЖХ прежде всего относится большая длительность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких растворителей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из этого следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необратимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмечались в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по-мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция приводит к получению хроматограммы, на которой полностью или частично отсутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому разложению компоненты пробы.

 

• Распредилительная хроматография.

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза).

Первые сорбенты такого типа получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители. Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесенной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также уменьшался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Позже стали привить химическими связями жидкую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физически невозможен, т. Е. превратить носитель и фазу в одно целое, так называемый привито-фазный сорбент. Эти так называемые «щеточные» сорбенты показали, что с их использованием действительно удается получить высокую эффективность колонок при отсутствии уноса фазы из колонки и стабильности времен удерживания. Однако устойчивость таких сорбентов в условиях применения водных растворителей и даже слабоосновных или кислых сред была низкой: фаза отщеплялась химически за счет реакции гидролиза.

 

В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как полярными, так   и неполярными группами на поверхности.