Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

      Ценность  зондовой флуоресценции состоит  не только в её большей чувствительности к структурным изменениям молекулы белка, но и в том, что поведение зонда в белке является моделью поведения различных метаболитов, которые взаимодействуют с альбумином. Так, например, по результатам зондовой флуоресценции можно спрогнозировать, что при действии высоких концентраций мочевины некоторые метаболиты, переносимые альбумином останутся в связанном с ним состоянии, хотя транспортная функция альбумина будет значительно нарушена.

      Интересным  является и тот факт, что при  значительной дестабилизации третичной  структуры, происходит миграция энергии  с триптофана на АНС (рисунки 8 – 13). На этих графиках наблюдается значение ИФ, неравное нулю. ИФ с ростом концентрации мочевины постепенно падает и при  концентрации 10М падение прекращается, это говорит о существовании  определённого денатурирующего  предела у мочевины по отношению к альбумину. Т.о. данный факт ещё раз подтверждает то, что мочевина не полностью разрушает конформацию белка. Рисунки 8 – 10 наглядно отражают процесс миграции энергии с триптофана на АНС, где видно падение триптофановой флуоресценции на фоне возрастания зондовой флуоресценции.

      При изучении зависимости ИФ собственной  от рН среды, взглянув на графики рисунков 5 – 7, можно сделать вывод о  том, что ИФ при концентрации мочевины, равной нулю, в щелочной среде намного  ниже, чем значения ИФ для кислой и нейтральной среды. Этот факт обусловлен тушением флуоресценции триптофана. Причиной тушения флуоресценции  в щелочной среде может являться миграция энергии с триптофанила на ионизированный тирозинил.

      Учитывая  литературные данные о том, что молекула альбумина обладает высокой степенью шероховатости поверхности, т.е. её поверхность изрезанна, содержит складки, щели карманов и петель, можно сделать вывод, что влияние мочевины в первую очередь направленно на неплотно упакованные участки в структуре белка.

      Значительным  структурным изменениям, даже при  сверхвысоких концентрациях мочевины, возможно, препятствует система S – S – связей, расположенных регулярно по всей длине полипептидной цепи.  

3.2 Влияние свободных  радикалов на структуру  молекулы альбумина 

      Профиль элюции сывороточного альбумина на TSK -HW55 геле отражен на рисунке 14. 

        

     Pиcунок 14 – Профиль элюции сывороточного альбумина на TSK -HW55 геле после действия перекиси водорода с сульфатом меди (II)  

     1 - исходная мономерная фракция сывороточного альбумина; 2 - мономерная фракция альбумина с СuSO₄ через 2 часа после добавления H₂O₂

        Флуоресценция белковых фракций  после действия пероксида водорода  с сульфатом меди (II) представлена на рисунке 15. 

        

     Рисунок 15 – Спектры флуоресценции белковых фракций, после действия CuSO₄ через 2 часа после добавления Н₂О₂ [49] 

     1 - димер, 2 - мономер (исходный белок), 3  - белковая фракция с массой меньшей,  чем исходный мономер, длина волны возбуждения 290 нм. 

      При возбуждении белковой фракции УФ излучением волной 290 нм наблюдали появление кроме полосы флуоресценции триптофана дополнительной полосы флуоресценции, которая не наблюдается в исходном белке. Можно предположить, что данное свечение появляется в белке вследствие образования новых флуорофоров при окислении свободными радикалами остатков аминокислот белка. Длинноволновый максимум в спектре флуоресценции совпадает с максимумом полосы свечения, возникающего при действии гидроксильных радикалов на гистидин (рисунок 16). 

 

     Рисунок 16 – Спектры флуоресценции триптофана (l) и гистидина(2) 

     1;1’  и 2;2’ до и после действия  СuSO₄ и H₂O₂ (λ возбуждения 290нм), 2;2’’ до и после действия СuSO₄ и H₂O₂ (λ возбуждения 360 нм), рН – 6,8 

     Свободные радикалы в эксперементе образовывались по реакции Вейсса – Габера, суть которой заключается в том, при, что при действии металла переменной валентности, являющегося одноэлектронным  донором, на пероксид водорода, образуются свободные радикалы. Реакция Вейсса – Габера состоит из нескольких стадий, показанных на рисунке 17.

 

     Рисунок 17 – Реакция Вейсса – Габера   

     Обращает на себя внимание тот факт, что при воздействии СuSO₄ через 2 часа после добавления H₂O₂ на белки тиольные соединения практически не образуются. Этот эффект связан с образованием очень реакционных свободных радикалов ОН∙, которые с высокой скоростью взаимодействуют с S-S связями: 

     ∙ОН+RS-SR→RSOH+RS∙ 

     Радикалы  ОН∙, реагируя с дисульфидами, дают сульфоновую кислоту и другие продукты окисления, вплоть до цистеиновой кислоты.

     Образовавшиеся  радикалы RS∙ взаимодействуют с высокой скоростью с радикалами ОН∙. Так как скорость реакции радикалов ОН∙ с тиолами выше, нежели с цистином, то реакции:   

     RSН+ОН∙→ RS∙+H₂О и RS∙+ОН∙ → RSОH 

приобретают основное значение, и тиольные продукты не образуются.

      Образовавшиеся  радикальные продукты R, взаимодействуя с ∙ОН, дают также аланин, серин, глицин, но только в очень малых количествах. Образовавшиеся анионы сероводорода окисляются радикалами ОН.

     Однако в присутствии кислорода очень эффективно протекает реакция с образованием супероксидного радикала, дисмутация которого дает в конечном результате перекись водорода Н₂О₂. Пероксид водорода, в свою очередь в результате реакции с супероксидным радикалом генерирует чрезвычайно активный окислитель – гидроксильный радикал.

 

      ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

      В результате проведённого эксперимента по влиянию сверхвысоких концентраций мочевины на сывороточный альбумин, были получены данные, исходя из которых, можно сделать вывод, что концентрации мочевины 2 – 10 М не способны полностью разрушить третичную структуру белка, не говоря уже о первичной и вторичной структурах альбумина. Данный факт ещё раз подтверждает уникальность строения молекулы альбумина.

      Несмотря  на не полное разрушение третичной структуры, данный факт сильно угнетает способность альбумина транспортировать различные низкомолекулярные метаболиты организма. 

     Полученные  результаты можно с успехом перенести  на человеческий сывороточный альбумин, что очень важно для медицины в изучении патогенеза таких заболеваний  как почечная недостаточность, цирроз печени.

     Также, исследуя качество структуры молекулы альбумина, флуоресцентным методом, можно спрогнозировать степень тяжести состояния больного в очень короткие сроки.

     Влияние свободных радикалов на молекулу альбумина показало, что происходит разрушение альбумина на уровне первичной  структуры. Причём главная роль в  этом разрушении принадлежит сильно реакционно способному радикалу ∙ОН.

     Гидроксильные радикалы могут образовываться при  повышении содержания в организме  тяжёлых металлов, которые при  взаимодействии с пероксидом водорода, по реакции Вейсса – Габера, образуют различные агрессивные формы  кислорода, окисляющие альбумин. В результате таких процессов альбумин не может выполнять ключевых функций для организма.

     Данный  эксперимент можно также использовать в качестве модели влияния ионизирующего излучения на альбумин, в силу того, что при действии ионизирующего излучения на водные растворы, происходит радиолиз воды, сопровождающийся образованием свободных радикалов.

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

      

          1 Граник, В. Г. Основы медицинской  химии / В. Г. Граник. – М.:Вузовская  книга, 2001. – 384 с.

          2  Альбумин сыворотки крови  в клинической медицине / Под ред.  Ю. А. Грызунова, Г. Е. Добрецова.  – М.: ИРИУС, 1994. – 226 с.

          3  Чёгер, С.И. Транспортная функция  сывороточного альбумина / С. И.  Чёгер. – Бухарест.: Изд-во Академии  СРР, 1975. – 183 с.

          4  Луйк, А.И. Сывороточный альбумин  и биотранспорт ядов / А. И. Луйк, В. Д. Лукьянчук. – М.: Медицина, 1984. – С. 12-29.

     5 Биохимия человека / Р. Мари, Д  Греннер, П Мейес, В Родуэлл.  – М.: Мир, 1993. – С.256-273.

     6  Альбумин сыворотки крови в  клинической медицине. Книга 2 / Под  ред. Ю. А. Грызунова, Г. Е.  Добрецова. – М.: Медицина, 1998. - С. 28-51.

     7   Кантор, Ч. Биофизическая химия:  в 3 т. Т.2. Пер. с англ / Ч. Кантор, П. Шиммел,– М.: Мир, 1984. –– 496 с.

     8    Практическая химия белка: Пер.  с англ. / Под ред. А. Дарбре. – М.: Мир, 1989. – 623 с.

     9   Кольман, Я. Наглядная биохимия: Пер. с нем. / Я.  Кольман, К.-Г.  Рем,– М.: Мир, 2000. – 469 с. 

         10  Березов, Т.Т. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. / Т.Т. Березов, Б. Ф. Коровкин,– М.: Медицина, 1998. – 704 с.

         11  Лабораторная гематология / С. А. Луговская, В. Т. Морозова, М. Е. Почтарь, В. В. Долгов  – М.: ЮНИМЕД-пресс,  2002. - 116 с.

         12 Гольдберг, Е.Д. Справочник по гематологии / Е.Д. Гольдберг. – Томск: Изд-во ТГУ, 1989. – 420 с.

         13 Физиология кровообращения /Отв.  ред. Б.И. Ткаченко. – Л.: Наука, 1984. – 652 с.  

         14 Физиологические показатели организма здорового человека: Морфологический состав и биохимические показатели крови / Е.К. Алимова и др. – Ростов н/Д., 1985. – 84 с.

          15 Лебедева, М. И. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа: учеб. пособие / М. И. Лебедева. – Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2005. – 216 с.

          16 Бартенев, Г.М. Физика полимеров /  Г. М. Бартенев, С. Я. Френкель; под ред. А.М. Ельяшевича. – Л.: Химия, 1990. – 432 с.

          17 Браун, Д. Спектроскопия органических веществ: Пер. с англ. / Д. Браун, А. Флойд,  М. Сейнзбери. – М.: Мир, 1992. – 300 с.

          18 Сенов, П. Л.  Фармацевтическая  химия / П. Л. Сенов. – 8-е  изд., перераб. и дополн. – М. :  Медицина, 1978. – 480 с.         

          19 Черницкий, Е. А. Спектральный  люминесцентный анализ в медицине /   Е. А. Черницкий, Е. И.  Слабожанин. – Мн.: Наука и техника, 1989. – 141 с.

          20 Машковский, М. Д. Лекарственные  средства. В двух частях. Ч.1. / М.  Д. Машковский. – 12-е изд., перераб.  и дополн. – М.: Медицина, 1998. –  736 с.

          21 Добрецов Г. Е. Флуоресцентные  зонды в исследовании клеточных  мембран и липопротеинов / Г.  Е. Добрецов. – М.: Наука, 1989. –  277 с.

          22 Захаревский, А. С.. Фармакология  с рецептурой: учебник / А. С  Захаревский, Б. Б. Кузьмицский,  Л. Д. Курлович. – Мн.: Высш. шк., 2004. – 304 с. 

          23 Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / Под ред. Т. Т. Березова. – М.: Медицина, 1976. – 294 с.

      24 Миллер, Ю. И. Использование флюоресцентного зонда в оценке связывающей способности сывороточного альбумина человека при печеночной недостаточности / Ю. И. Миллер // Лаб. Дело. – 1989. - №7. – С. 20-23.

     25 Тарусов, Б. Н. Биофизика / Б.  Н. Тарусов, В. Ф. Антонов.  – М. : Высшая школа, 1969. – 467 с.

     26 Владимиров, Ю. А. Флуоресцентные  зонды в исследовании биологических  мембран / Ю. А Владимиров, Г.  Е. Добрецов. – М.: Наука, 1980. -320 с.

     27 Биохимические методы исследования  в клинике / Под. Ред. А. А.  Покровского. – М.: Медицина, 1969. –  652 с.

     28 Казицына, С. Я. Биофизика / С.  Я. Казицына, И. В. Сомова. –  М.: Высшая школа, 1990. – С. 212-215.