Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

     2 ОБЪЕКТ, ПРОГРАММА  И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ 
 

      Объектом  исследования являлся бычий сывороточный альбумин фирмы «Sigma-Aldrich».

      Целесообразность  использования бычьего сывороточного  альбумина для эксперимента по сравнению  с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) заключается в том, что БСА  имеет два триптофанила, а ЧСА  только один, находящийся в поверхностной  гидрофобной складке молекулы. Именно остатками триптофана обусловлен основной вклад в собственную флуоресценцию  белка. Причём в молекуле БСА один триптофанил располагается там  же, где и триптофанил молекулы ЧСА, а второй спрятан внутри белковой глобулы. Если произойдёт разворачивание белка под действием каких-либо факторов, то внутренний триптофанил  выйдет на поверхность и флуоресценция  белка увеличится. В случае ЧСА  увеличение интенсивности флуоресценции  наблюдаться не будет.

      Полученные  результаты исследований можно будет  с полной достоверностью перенести  на молекулу ЧСА, т.к. БСА и ЧСА  отличаются друг от друга на три  аминокислоты и положением некоторых  аминокислот, а в целом структуры  этих молекул идентичны.

      Предметом исследования явилось изучение конформационных  изменений и структуры альбумина  в целом под действием физико-химических факторов.

      Программа исследований включала постановку и  решение следующих задач:

1. Исследование влияния сверхвысоких концентраций мочевины на конформацию альбумина.

  2)  Влияние свободных радикалов на структуру молекулы альбумина.

      Методом изучения влияния сверхвысоких концентраций мочевины на конформацию альбумина  была флуоресцентная спектроскопия. Параметр флуоресценции – интенсивность.

      Влияние свободных радикалов на структуру  молекулы альбумина исследовали  методом гель-хроматографии и  флуоресцентной спектроскопии. 

      Флюоресценцию растворов альбумина исследовали  на спектрофлюориметре марки СМ 2203 Solar. Хроматографию проводили на TSK - HW55 геле.

      Эксцинцию для собственной флуоресценции устанавливали на приборе при длине волны 280, 290 нм, эмиссию при длине волны 350 нм. Эксцинцию зондовой флуоресценции устанавливали при длинах волн 280, 290 и 320 нм, эмиссию – при длине волны 450 нм. 

      Для изучения влияния различных концентраций мочевины на бычий сывороточный альбумин (БСА) использовали концентрацию белка, равную 0,66 г/л, или 10^-5 моль/л. Раствор БСА с концентрацией 10^-5 М готовили в трёх различных буферах: фосфатный с рН 7,43, трис-буфер с рН 9,08, ацетатный с рН 4,54.

        Концентрация БСА 0,66 г/л является  оптимальной, т.е. флуоресценция  белка связана прямопропорциональной  зависимостью с концентрацией.  Для нахождения данной концентрации  строили калибровочный график  зависимости интенсивности флуоресценции  от концентрации белка. На графике  нашли отрезок, характеризующийся  прямой пропорциональной зависимостью  и, поделив его пополам, получили  значение оптимальной концентрации  альбумина. 

      Концентрации  мочевины, которые брались для эксперемента находились в интервале от 2М до 10 М.

      По  сравнению с соотношением содержания мочевины и сывороточного альбумина  в организме (10 : 1), для эксперимента бралось соотношение мочевины и  альбумина 1 : 10000 – 100000 соответственно. Т.о концентрации мочевины были взяты сверхвысокими.

      Помимо  собственной флуоресценции белка  исследовали зондовую флуоресценцию. В качестве зонда использовали N-фенил-1-амино-8-сульфонафталин (АНС). Количество зонда, необходимое для реакции с альбумином, рассчитывали, исходя из того, что количество центров на альбумине для АНС равно 5 – 6. Поэтому концентрация зонда для эксперимента взяли равной 6 ∙ 10^-5 моль/л.

      Данные  зондовой флуоресценции наряду с  данными о собственной флуоресценции  могут дать дополнительную информацию о конформационных изменениях белка, т.к. зондовая флуоресценция более  чувствительна к изменениям структуры  белка, чем собственная флуоресценция.

      Для изучения влияния свободных радикалов  на бычий сывороточный альбумин использовали концентрацию альбумина 10^-5 М. Раствор альбумина готовили в фосфатном буфере (Na₂HPO₄ – KH₂PO₄ (1/15M)) с pH = 7,44, близкой к физиологическому значению рН крови. Свободные радикалы образовывались в растворе альбумина, по реакции Вейсса – Габера, путём добавления смеси пероксида водорода с концентрацией 3 · 10^-5 и сульфата меди (II) – 12 · 10^-4 моль/л.

      В организме человека пероксид водорода и ионы меди (II) содержатся в количествах, примерно равных 30 мкмоль/л и 12 мкмоль/л соответственно.

      При таком соотношении в организме  свободные радикалы практически  не образуются, но при повышении  концентрации ионов меди (II), вследствие их чрезмерного поступления извне, происходит образование свободных радикалов.

      Ход эксперимента выглядел следующим образом. Вначале приготовили контрольную  пробу, в которой находился раствор  альбумина с пероксидом водорода. Затем готовили опытный раствор  альбумина, куда добавили вначале пероксид водорода, а затем, через два часа – сульфат меди (II) выше указанных концентраций соответственно. Далее опытную и контрольную пробу нанесли на колонки, содержащие гель TSK - HW55. Собрали элюированные пробы и получили профиль элюции белков.

      Затем проводили флуоресцентную спектроскопию белковых фракций, полученных элюированием сывороточного альбумина на геле TSK - HW55. Длина волны возбуждения ультрафиолетом (УФ) равнялась 290 нм, длина волны регистрации флуоресценции составляла 350 нм.

     При возбуждении фракции УФ излучением с длиной волны 290 нм, наблюдали появление, кроме полосы флуоресценции триптофана, дополнительной полосы флуоресценции, обладающей длинноволновым сдвигом, с длиной волны 360 нм.

     Предположили, что данная полоса свечения возникла при окислении свободными радикалами остатка гистидина. Для проверки данной гипотезы провели химическую реакцию взаимодействия гистидина  со смесью сульфата меди и пероксида  водорода. Затем производили измерение  флуоресценции продуктов окисления  гистидина. Максимум интенсивности  флуоресценции соответствовал длине  волны 360 нм, что совпадало с флуоресцентной характеристикой дополнительной полосы свечения  белковой фракции.

     Далее изменили длину волны возбуждения  на 360 нм и регистрировали появление нового спектра флуоресцеции, обладающего длинноволновым сдвигом.

 

        3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 
 

       3.1 Исследование влияния сверхвысоких концентраций мочевины на конформацию альбумина 

     В результате проведения эксперимента были получены результаты, отражённые на графиках зависимости интенсивности собственной  и зондовой флуоресценции от концентрации мочевины и длины волны возбуждающего  и эмиссионного света.

     Для интерпретации полученных результатов нужно упомянуть, что в нативном белке в водных растворах собственная флуоресценция, обусловленная триптофаном наблюдается при значении длины волны экстинции на 280 -290 нм и при значении длины волны эмиссии на 350 нм. Экстинция зонда АНС = 320 нм, а эмиссия – 450 нм.

      Из  полученных результатов следует, что  сверхвысокие концентрации мочевины уменьшают  интенсивность как собственной  так и зондовой флуоресценции. Это  можно увидеть на рисунках 5 – 10. Однако падение интенсивности собственной  флуоресценции белка носит сложный  нелинейный характер. В некоторых  участках кривых отмечается даже незначительное увеличение интенсивности. Например, на графиках зависимости собственной  флуоресценции от концентрации мочевины показано, что в кислой среде (рисунок 5) незначительное увеличение интенсивности  флуоресценции (ИФ) наблюдается при концентрации мочевины 8М, в нейтральной среде (рисунок 6) – при концентрации мочевины 5М и 8М, в щелочной среде (рисунок 7) – при концентрации мочевины 5М. Очевидно, что результатом такого характера кривых является различие в рН среды, в которой находится альбумин, что подтверждает литературные данные о существовании разных форм альбумина в зависимости от рН среды. 

 

     Рисунок 5 – График зависимости интенсивности флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 4,54 

 

     Рисунок 6 – График зависимости интенсивности флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 7,43  

 

           Рисунок 7 – График зависимости интенсивности флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 9,08 

      Падение интенсивности зондовой флуоресценции (рисунки 8, 9, 10) при возбуждении длиной волны 320 нм имеет более спокойный  и плавный характер.

    

 

           Рисунок 8 – График зависимости интенсивности зондовой флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 4,54   

 

     Рисунок 9 – График зависимости интенсивности флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 7,43   

 

     Рисунок 10 – График зависимости интенсивности флуоресценции альбумина от концентрации мочевины при рН = 9,08   

      Обычно  зондовая флуоресценция альбумина, обусловленная зондом АНС, появляется при возбуждающем свете с длиной волны равной 320 нм и регистрируется флуориметром на длине волны равной 450 нм. Исходя из данных, что АНС в альбумине располагается рядом с триптофанилом, обуславливающим собственную флуоресценцию белка, следует, что возможна миграция энергии с триптофана на зонд АНС. Если возбуждающий свет на спектрофлуориметре поставить на длину волны 290 – 280 нм (что характерно для спектра поглощения триптофана), а регистрировать флуоресценцию на 450 нм, то можно наблюдать миграцию энергии. Такой приём отражён на рисунках 5 – 7 (кривые на графиках данных рисунков отмечены квадратами (λ_возб. 290 нм) и кружками (λ_возб. 280 нм).

     На  рисунках 11 – 13 изображены графики, показывающие как изменяется спектр поглощения триптофана и зонда в длинах волн, при различных рН средах.

      Суммируя  выше изложенное можно заключить, что  падение интенсивности собственной  и зондовой флуоресценции в присутствии  мочевины обусловлено её денатурирующим действием. Так, известно, что в растворах  мочевины неполярные находятся в  менее энергетически выгодном окружении, чем в чисто водных растворах. Это ведёт к дестабилизации гидрофобных связей. В результате третичная структура начинает нарушаться, а триптофанил стремится уйти в более гидрофобную часть белковой глобулы. Свидетельством тому является наблюдаемое на графиках (рисунков 11 – 13) коротковолновое смещение спектров флуоресценции триптофана. Обычно коротковолновые сдвиги флуоресценции триптофана при попадании в неполярное сопровождаются и увеличением ИФ, однако в эксперименте взяты настолько высокие концентрации мочевины, что происходит обширная дезорганизация нативной структуры альбумина. При таком разрушении третичной структуры триптофан возможно лишается того микроокружения в котором он был в нативном белке, что и уменьшает интенсивность флуоресценции. Так же возможны и процессы тушения флуоресценции триптофана соседними группами, в результате конформационного изменения альбумина. 

 

     Рисунок 11 – Спектры зондовой флуоресценции  альбумина (280 нм) при действии на него мочевиной (2 – 10М) при рН 4,54   
 

      

 

     Рисунок 12 – Спектры зондовой флуоресценции  альбумина (280 нм) при действии на него мочевиной (2 – 10М) при рН 7,43

 

 

     Рисунок 13 – Спектры зондовой флуоресценции  альбумина (280 нм) при действии на него мочевиной (2 – 10М) при рН 9,08 [48] 

      Обращает  на себя внимание и тот факт, что  даже при концентрации мочевины, превышающей  физиологическое соотношение белка  и мочевины в организме в 100000 раз, мочевина не разрушает первичную  и вторичную структуру альбумина. Об этом свидетельствуют графики  рисунков 5 – 7 (собственная флуоресценция) и 8 – 10 (зондовая (кривые с треугольниками)). На этих графиках ИФ хотя и падает, но далеко неравна нулю.

      Доказательством неполного разрушения третичной  структуры может служить тот  факт, что интенсивность зондовой флуоресценции неравна нулю, даже при концентрации мочевины 10М. Это значит что зонд – АНС располагается на своём центре в альбумине. Если бы третичная структура была полностью нарушена, то зондовая флуоресценция отсутствовала, что выразилось бы значением зондовой ИФ, равной нулю. Однако тот факт, что ИФ зонда падает, говорит о частичном разрушении центров для АНС.