Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

     Многие  метаболиты и лекарственные вещества конкурируют между собой за связывающие центры альбумина. Это обстоятельство должно обязательно учитываться при назначении лекарственных препаратов. Например, цефалоспорины и другие антибиотики, связываясь с ЧСА, могут вытеснять из него билирубин [41].

     Альбумин  вносит значительный вклад в защиту организма от вредного действия свободных радикалов. Это достигается, в частности, связыванием металлов переменной валентности, в результате чего их радикалобразуюшая активность уменьшается в 100 раз. Кроме этого, в норме молекула альбумина содержит одну восстановленную SH-группy, которая легко окисляется, в том числе в реакциях с участием радикалов. При этом происходит образование стабильных продуктов (дисульфидов, сульфоновых кислот). Это значит, что альбумин, таким образом, обрывает цепи радикального окисления и является антиоксидантом крови. В физиологических условиях около 80% всех определяемых тиолов плазмы составляют именно тиолы альбумина. Некоторые исследователи частично связывают положительный эффект препаратов альбумина при критических состояниях с увеличением концентрации активных тиолов. По-видимому, и другие группы альбумина (например, аминогруппы) способны вступать в реакции с радикалами, защищая организм от окислительного стресса [42].

     Считается, что альбумин вовлечен в реакции  с участием радикалов не специфически, а в силу того, что его концентрация во внеклеточном пространстве относительно высока, и обмен его происходит относительно быстро, около 20 дней.  
 

     1.5 Основное понятия и закономерности люминесценции 

     Понятие «люминесценция» относят не к  отдельным атомам и молекулам, а  к совокупностям – телам и  тесно связывают с температурой среды. Последнее вызвано тем, что  элементарные акты возбуждения молекул  и испускания света могут быть одинаковыми в случае теплового  излучения и люминесценции. Согласно определению Видемана – Вавилова, люминесценция – излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре и  имеющее длительность, существенно  превышающую период световых колебаний.

     В зависимости от источников, вызвающих  люминесценцию, она подразделяется на триболюминесценцию (механические деформации некоторых кристаллов), фотолюминесценцию (свет), сонолюминесценцию (звуковая волна – индуктор) и  т.д.

     Спектральная  область, обычно используемая для люминесценных измерений (200 – 800 нм), соответствует электронным переходам в молекуле. Поглощение молекулой кванта света в этой области спектра приводит к переходу электрона на более высокий энергетический уровень.

     Поглощение  света происходит за время порядка 10^-15 с, что соответствует периоду колебаний световой волны. В течение этого времени заметно не изменяются ни положение, ни импульсы тяжёлых ядер и их относительное движение до акта поглощения света и сразу же после него одинаковы.

     Молекула, попавшая на верхние колебательные  уровни любого возбуждённого состояния, быстро теряет избыток колебательной  энергии при столкновениях с  окружающими молекулами. Это процесс  колебательной релаксации. Безызлучательный переход между электронными состояниями  одинаковой мультиплетности называется внутренней конверсией, аналогичный переход между состояниями разной мультиплетности – интеркомбинационной конверсией [43].

     Возможны  два вида интеркомбинационной конверсии: переход S₁ – S₀ (из первого синглетного возбуждённого в основное синглетное состояние соответственно) и переход Т₁ – S₀ (из триплетного возбуждённого состояния в основное синглетное соответственно).

     Помимо  безызлучательного перехода молекула может попасть в основное состояние  S₀, испустив квант люминесценции. Если квант был испущен с синглетного возбуждённого состояния, то такой тип люминесценции называется флуоресценцией. Длительность флуоресценции составляет 10^-8 – 10^-10 сек.

     Возможен  и другой путь излучательной релаксации возбуждённого синглетного состояния. Возбуждённая молекула может безызлучательным путём перейти в триплетный возбуждённый уровень с изменением спина.

     Это так называемое метастабильное состояние. Перейдя на триплетный уровень, молекула может находится на нём примерно 10^-3 – 10 сек, что значительно больше длительности синглетного возбуждённого состояния.

     Свечение, испускаемое при переходе молекулы с триплетного в основное синглетное состояние называется фосфоресценцией.

     Оcновными характеристиками, параметрами люминесценции являются её спектры, выход, длительность и поляризация [44].

     Люминесценция белков может быть обусловлена аминокислотами, входящими в состав полипепидной цепи макромолекул (собственная люминесценция), простетическими группами (восстановленные  пиридиннуклеотиды и флавины), связанными с белковой частью сложных ферментов, химически присоединённой меткой (красителем), а также зондом (зондовая люминесценция).

     Собственная люминесценция белка обусловлена в целом аминокислотами, имеющими ароматический радикал, а значит это – триптофан, тирозин, гистидин, фенилаланин. Поглощение этих аминокислот в области 250 – 300 нм довольно значительно. Из других аминокислот только цистин имеет в этой области поглощение, сравнимое с фенилаланином ε_{240 = 300}, ε_{290 = 50}; пептидная связь поглощает в области более 220 нм. Включение ароматических аминокислот в состав белков сопровождается небольшим сдвигом в «красную» сторону, при этом слегка увеличивается поглощательная способность хромофоров[45].  
 

     1.6 Применение зондовой  флуоресценции для  изучения структуры молекулы альбумина  

     Способность красителей связываться с белками и реагировать на состояние белковой молекулы, известна давно. Вначале о структуре и поведении альбумина судили по изменению поглощения света красителем. И.Клотц использовал метиловый оранжевый и другие красители – органические кислоты с отрицательным зарядом [46]. По мере появления приборов, регистрирующих слабые потоки люминесцентного света, стали использоваться и флуоресцирующие красители. Флуоресценция обычно гораздо более чувствительна к изменениям окружения молекулы красителя, чем поглощение света, и имеет ряд других особенностей, благодаря которым флуоресцентные красители приобрели большое распространение в исследовании белков.

     Краситель может быть связан с белком ковалентно (необратимо) благодаря химической связи или нековалентно (обратимо) благодаря слабым гидрофобным и  электростатическим взаимодействиям. Первую группу обычно называют метками, вторую - зондами. В 1952 году Г.Вебер впервые применил флуоресцентную метку, а Д.Лоуренс - флуоресцентный зонд для изучения структуры альбумина. Выяснилось, что флуоресценция зондов очень чувствительна к перестройкам в глобуле альбумина, чего нельзя сказать, используя флуоресцентные метки. При связывании зонда АНС (1-амино-N-фенил-8-сульфонафталин) с альбумином интенсивность флуоресценции зонда возрастает в сотни раз. Это свойство АНС почти сразу же попытались использовать для клинического измерения концентрации альбумина в сыворотке. Однако оказалось, что при патологиях, особенно при гипербилирубинемии, флуоресценция АНС в альбумине снижается, что мешает количественному его определению.

     Активное  использование флуоресцентных зондов для изучения структуры белков началось с 1965 года. Наиболее подробно исследовано  взаимодействие с альбумином отрицательно заряженного зонда АНС. Имеется около 5 центров связывания АНС на молекуле альбумина. При этом 2-3 из них имеют более высокую константу связывания. Попадая в эти центры, молекула АНС оказывается в жестком окружении, а ее гидрофобная группа полностью скрыта от молекул воды. Примерно 90% флуоресценции АНС происходит именно из этих центров. Остальные 2-3 центра связывают АНС слабее, и в них зонд частично доступен воде. При переходе от рН 7 к рН 4 (N-F переход) константа связывания АНС сильными центрами снижается, однако число таких центров возрастает, за счет чего интенсивность флуоресценции АНС тоже возрастает. При этом сильные центры по-прежнему хорошо скрывают молекулу АНС от воды.

     Благодаря тому, что флуоресцируют практически только те молекулы АНС, которые связаны с альбумином, легко измерить параметры связывания зонда с белком.

     Незаряженный  зонд ДМХ (4-диметиламинохалкон) связывается с 2-3 центрами альбумина. Подобно АНС, он попадает в жесткое окружение, что видно по появлению кругового дихроизма, и скрыт от молекул воды, которые теперь уже не тушат флуоресценцию ДМХ. Молекула ДМХ контактирует в этих центрах с двумя остатками тирозина, расположенными вблизи поверхности белковой глобулы. Такой контакт с фенольными группами тирозина приводит к частичному тушению флоуресценции ДМХ. При переходе от рН 7 к рН 9 (переход N-B) эти два остатка тирозина ионизируются: один становится отрицательно заряженным к рН 9, второй – к рН=10,5. Остальные 16 остатков тирозина ионизируются только при рН > 10,5. В результате ионизации первых двух остатков тирозина они выходят на поверхность белка, оставив ДМХ в глубине центра связывания, их тушащее влияние уменьшается, и интенсивность флуоресценции ДМХ возрастает. В свою очередь, ДМХ перестает влиять на круговой дихроизм этих остатков тирозина. Дальнейшее увеличение рН приводит к разрыхлению белковой молекулы, что видно по снижению флуоресценции ДМХ, молекула которого становится теперь доступной тушащему действию молекул воды.

     При снижении рН от 7 к 3 (переход N-F) центры связывания ДМХ разрыхляются, в них проникает вода и тушит флуоресценцию ДМХ.

     Отрицательно  заряженный зонд К-35 был предложен  специально для исследования состояния  альбумина в сыворотке крови  при патологии. К-35 имеет величину константы связывания с альбумином примерно такую же, как АНС, около 1,8 ∙ 10 ⁵ М^-1, и занимает два типа центров. Примерно 23% связанных молекул К-35 находится в центрах одного типа, где аминогруппа зонда хорошо скрыта от молекул воды. Остальные 77% молекул – в центрах другого типа, где зонд частично доступен воде.

     В результате исследования конкуренции  флуоресцентных зондов с метаболитами и лекарственными веществами за центры связывания были найдены зонды-маркеры  различных центров альбумина: ДАНСил-амид (5-диметиламинонафталин-1-сульфониламид), ДАНСил-саркозин, ДАНСил-ундеканоевая кислота и производные 7-аминокумарина.

     Если  к раствору АНС добавить альбумин, то часть молекул зонда связывается  с альбумином, и интенсивность их флуоресценции возрастает в десятки-сотни раз. Однако при добавлении билирубина интенсивность флуоресценции АНС снижается, по-видимому, в результате конкуренции между билирубином и АНС. Изучение этой смеси показало, что билирубин не влияет на константу связывания АНС с альбумином, а уменьшает число центров связывания.

     Зонды конкурируют и с лекарственными веществами. Так, при добавлении ряда лекарственных веществ интенсивность флуоресценции АНС и К-35 в растворе альбумина снижается. При этом зонд К-35 гораздо чувствительнее к присутствию лекарств, чем АНС, хотя оба зонда имеют близкие величины констант связывания.

     После многочисленных исследований конкуренции подобных соединений за центры альбумина сложились следующие, достаточно упрощенные представления. Считают, что для связывания билирубина, лекарственных соединений и флуоресцентных зондов наиболее важны два центра:

     Центр I расположен во втором домене альбуминовой глобулы. В его формировании участвует область полипептидной цепи, включающей лизин-199 и триптофан-214. Маркерами этого центра являются фенилбутазон и незаряженный флуоресцентный зонд ДАНСил-амид.

     Центр II формируется участком полипептидной цепи первого домена, включающим аргинин-145 и лизин-194. Его маркерами являются иопановая кислота и отрицательно заряженный флуоресцентный зонд ДАНСил-саркозин. Как следует, связывание отрицательно заряженного зонда К-35 с альбумином нарушается маркерами обоих типов центров. Возможно, К-35 связывается как с центром II, так и с центром I. Однако пример с билирубином, рассмотренный выше, показывает, что вполне возможны влияния одних центров на другие, а не только прямая конкуренция вещества и зонда за один и тот же центр [47].

     Обобщая обзор литературы можно прийти к выводу о многообразии функции, выполняемых сывороточным альбумином. Такое многообразие определяется уникальным строением данного белка, причём структура сывороточного альбумина настолько лабильна, что даже при небольшом изменении интенсивности физико-химических факторов (рН, температура, денатурирующие агенты), в белке происходят конформационные изменения, которые в свою очередь отражаются на функциях, выполняемых альбумином.

     Наличие таких остатков аминокислот как: тирозин, фенилаланин и, в особенности, триптофан позволяет с успехом  использовать очень чувствительный физико-химический метод в аналитической  химии – флуоресцентная спектроскопия.

     Благодаря открытию зондов (красители, нековалентно связывающиеся с белком), например АНС, который в связанном с  белком состоянии в сотни раз  интенсивнее флуоресцирует, чем  в несвязанном состоянии, стало  возможным изучать очень тонкие конформационные изменения, происходящие в альбумине и в других белках в целом.