Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

Министерство  образования Республики Беларусь 

Учреждение  образования

«Гомельский государственный университет 

имени Франциска  Скорины» 

Биологический факультет

Кафедра химии 
 

                                                           Допущено к защите

                                                              Зав. кафедрой __________ Шумилин В.А 

                                                        « _____ »  ______________ 2009г 
 
 
 

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ  МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ КОНФОРМАЦИОННЫХ  ИЗМЕНЕНИЙ АЛЬБУМИНА  В РАСТВОРЕ 
 

Дипломная работа 
 
 
 

Исполнитель:

студент группы Б-51  ____________  Корноушенко Юрий Валерьевич 

Научный руководитель:

к.х.н., доцент   ____________  Дроздова Наталья Ивановна  

Рецензент:                       

к.б.н., ассистент  кафедры       ____________  Галиновский Николай

зоологии и  охраны природы                            Генадьевич  

                                                    
 

Гомель 2009

 

 СОДЕРЖАНИЕ 
 

 
 
 
 

 

      ВВЕДЕНИЕ 
 

      Интерес к исследованию альбумина, неугасающий  за последние 40 лет, связан с открытием  всё новых его функций в  организме. Уже одна цифра, указывающая  его содержание в крови (60% - от всех белков плазмы), говорит о ключевом значении альбумина для выполнения кровью своих функций. С другой стороны его распространённость в различных физиологических жидкостях (интерстициальной, лимфе), а также различных тканях говорит о большой важности именно этого белка для организма, по сравнению с другими.

      Для доказательства таких выводов, надо обратиться к строению альбумина. В 70-х – 80-х годах была расшифрована аминокислотная последовательность и  в целом пространственная структура  сывороточного альбумина. Оказалось, что уникальное строение альбумина, позволяет ему связывать различные  по своей химической природе вещества (альдегиды, алканы, жирные кислоты, металлы  постоянной и переменной валентности  и м.д. низкомолекулярные вещества) и переносить их в крови. Таким образом, ключевая функция альбумина – транспортная. Позже было выяснено участие альбумина в антиокислительных процессах, в поддержании онкотического давления плазмы и даже в направленной локомоции нейтрофилов в очаги воспаления и т.д.

      Из  выше изложенного можно заключить, что значение альбумина в поддержании гомеостаза огромно. Однако известно, что при связывании альбумина с различными лигандами, его конформация определённым образом изменяется и это может отразиться на его связывании с другими лигандами. Флуоресцентным методом можно зарегистрировать многие тонкие конформационные изменения альбумина и судить о качественном состоянии белка, а по качеству структуры альбумина, можно оценить и степень патологического состояния организма.     

  Цель работы: изучение конформационных изменений бычьего сывороточного альбумина под действием свободных радикалов и  сверхвысоких концентраций мочевины.

      Практическое  значение работы заключается в том, что полученные данные могут быть использованы в медицине, при расшифровке патогенеза таких заболеваний как почечная недостаточность, цирроз печени. Также, используя мочевину в качестве денатурирующего агента, можно смоделировать процесс взаимодействия альбумина с различными лигандами в условиях метаболитного стресса.   

     Научная значимость: в силу высокой чувствительности флуоресцентного метода и уникальности молекулы альбумина как объекта для изучения данным методом его структуры, полученные результаты могут иметь большое значение для химии глобулярных белков схожего с сывороточным альбумином строения.

     1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 
 

     1.1 Определение понятия «альбумин» 

     В 1838 году G. Mulder обнаружил, что в тканях животных и растениях содержатся вещества, напоминающие по своим свойствам  яичный белок. Постепенно было установлено, что белки представляют собой  обширный класс веществ, построенных  по определённому плану. Выяснилось, что белки можно разделять, осаждая  их из растворов с различной концентрацией  сульфата аммония. Согласно одной из первых классификаций белков (P. Panum, 1852) альбумины – это белки, остающиеся в растворе полунасыщенного сульфата аммония.

     Спустя  почти век этот метод разделения белков уступил место электрофоретическому методу. В 1937 году А. Тизелиус разработал способ аналитического разделения белков электрофорезом в растворе, затем  для борьбы с тепловой конвекцией стали использовать растворы с градиентом плотности сахарозы и, наконец, перешли  к электрофорезу на различных  носителях (бумага, крахмальный гель и т.д.) [1].

     Согласно  молекулярно-биологической классификации  альбумин относится к мультигенному  семейству белков, включающему в  себя α-фетопротеин, группоспецифический  компонент, витамин D-связывающий протеин.

     В медицине понятие «альбумин» относят  только к одному виду белков человека, который обычно называют «сывороточным  альбумином» (ЧСА).

     Сывороточный  альбумин человека (ЧСА) – это глобулярный  белок с молекулярной массой около 66,4 килодальтон (кДа), не осаждающийся при pH 6 – 7 в полунасыщенном растворе сульфата аммония.. Главным местом синтеза ЧСА в организме является печень, где одна молекула этого белка синтезируется примерно за 20 минут, а в сутки – около 10 – 15 грамм альбумина. В плазме крови концентрация ЧСА – около 35-50 г/л, что составляет 47 – 62 % всех белков плазмы, в лимфе – 15 – 36 г/л, в межклеточной жидкости – 3 г/л, в ликворе – 0,3 г/л. Всего в кровеносном русле человека содержится около 120 – 140 грамм альбумина, во внеклеточном пространстве – около 360 грамм. Время существования молекулы альбумина в организме человека – около 20 дней [2]. 
 

1.2 Современные представления  о структуре молекулы  сывороточного альбумина 

     В настоящее время расшифровка  первичной структуры человеческого  и бычьего сывороточного альбумина  полностью завершена. Необходимо отметить, что структура ЧСА и БСА достаточно тесно согласуются друг с другом, отличаясь лишь в некоторых незначительных деталях положения отдельных аминокислот. ЧСА состоит из 585 аминокислотных остатков, БСА – 582.

     При сравнении первичной структуры  альбуминов различных видов, в частности  ЧСА и БСА, наиболее примечательной является стабильность положения заряженных аминокислот (Lys, Glu, Asp). Возможно, что локализацией этих остатков определяются значительные особенности данного белка. Так, значительное число заряженных групп и характерная для альбумина низкая изоэлектрическая точка является важным фактором его онкотической функции. Кроме того, большое число полярных остатков удерживает в растворе обширные гидрофобные участки белковой молекулы. Последний факт имеет первостепенное значение в фиксации альбумином низкомолекулярных соединений [3].

     Интересной  особенностью первичной структуры  ЧСА, является наличие единственного  остатка триптофана, который локализован  в положении 214. БСА имеет два  триптофановых остатка в положениях 134 и 212. Данный факт важен с методической точки зрения. Он позволяет с успехом  применять спектрофлюориметрию  при изучении конформационных перестроек альбумина, а учитывая, что БСА  и ЧСА практически идентичны  и в БСА содержится два триптофанила, которые могут давать большую  информацию о перестройках альбумина, чем один, можно с полной достоверностью переносить результаты, получившиеся с БСА в эксперименте, на ЧСА.

       Наряду с заряженными группами  уникальное значение имеет расположение  дисульфидных связей, определяющие  своеобразное свёртывание полипептидной  цепи. Всего в молекуле альбумина  имеется 35 остатков цистеина, причём  их локализация в ЧСА и БСА  абсолютно тождественна.

     Основная  заслуга в расшифровке аминокислотной последовательности БСА и ЧСА  принадлежит J. Brown. Его модель трёхмерного строения альбумина признаётся наиболее обоснованной и тщательно разработанной.

     J. Brown (1977) обратил внимание на тот факт, что характерной чертой первичной структуры альбуминов является многократное повторение спаренных остатков Cys-Cys. Всего в молекуле белка имеется 7 таких пар в положениях 90 – 91, 168 – 169, 245 – 246, 360 – 361, 437 – 438, 476 – 477 и 558 – 559 (рисунок 1).

     Вправо (по направлению к С-концу цепи) от каждой такой пары через 7 – 10 остатков расположен одиночный остаток Cys. Влево от пяти из имеющихся семи пар через 43 – 45 остатков также расположен одиночный Cys. Локализованные описанным образом остатки Cys, связываясь дисульфидными мостами, образуют пять больших двойных петель (рисунок 2,а). В остальных двух случаях одиночный Cys лежит на 15 остатков левее пары Cys–Cys. При этом образуются две малые двойные петли (рисунок 2, б).

     

 

     Рисунок 1 – Схематическое изображение  структурной организации сывороточного  альбумина человека [4] 

              

     

 

     Рисунок 2 – Схематическое изображение  образования больших (а) и малых (б) двойных петель молекулы альбумина [5] 

     Ещё одна малая двойная петля в  середине цепи (256 – 289) имеет несколько  иное строение. В центре два Cys лежат не рядом, как в остальных случаях, а разделены тремя аминокислотами (Pro – Glu – Lys). Кроме того вблизи N-конца имеется одна одинарная петля, включающая 10 аминокислот (53 – 62).

       Важной особенностью первичной структуры ЧСА, является наличие единственного остатка триптофана, который локализован в положении 214 (рисунок 3). 

     

 

     Рисунок 3 – Расположение остатка триптофана в молекуле ЧСА [6] 

     БСА имеет два триптофановых остатка  в положениях 134 и 212 (рисунок 2). Данный факт важен с методической точки  зрения. Он позволяет с успехом  применять спектрофлюориметрию при изучении конформационных перестроек альбумина, существенно облегчая интерпретацию полученных результатов.

     Таким образом, согласно модели, предложенной J. Brown, молекула альбумина содержит 5 больших двойных петель, 3 малых и 1 одинарную, в образовании которых участвует 17 дисульфидных связей. Единственная свободная SH-группа принадлежит цистеину, локализованному в ближайшем к N-концу положении (Сys³⁴) (рисунок 1). Этой сульфгидрильной группе отводится особое место в плане регуляции конформационных переходов белковой молекулы.

     Характерно, что только в двух из пяти больших  двойных петель имеет место одинаковое сочетание из четырёх аминокислот: Arg-Arg-His-Pro. Кроме того, вблизи вершины каждой большой петли имеется остаток Pro (рисунок 1, 2, а).

     С разнообразием аминокислотного  состава петель может быть связана, в числе прочих факторов, универсальность комплексообразующих свойств альбумина, способного фиксировать низкомолекулярные соединения разнообразного химического строения и стерической структуры.

     Если  представить, как это полагает автор  модели, что свободный N-концевой участок ранее в эволюции был также связан с ныне существующей единственной одиночной петлёй в большую двойную петлю, то всю молекулу альбумина легко разделить на три очень сходных домена: 1 – 190, 191 – 382 и 383 – 585. Каждый домен состоит из большой двойной петли, короткого соединительного сегмента, малой двойной петли, длинного соединительного сегмента, ещё одной большой двойной петли и соединительного сегмента со следующим доменом.