Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

     Каждый  из трёх доменов J. Brown подразделил на два субдомена (А – В, объединяющего большую и малую петли, и C, включающего одну большую петлю) и считает, что трёхмерная структура всех субдоменов сходна. Учитывая данные о высоком проценте α-спиральности молекулы (50 – 60%) альбумина J. Brown пришёл к выводу, что каждая большая петля состоит из двух спиральных участков, соединённых с одной стороны дисульфидным мостиком, а с другой – полипептидным фрагментом. Спирали, начинаясь от цистина, закручиваются антипараллельно и образуют 6 туров, в которые вовлекаются 20 аминокислотных остатков. Расчётная длина каждого спирального участка равна 3,2 нм, а с учётом промежутков на каждом конце длина петли соответствует примерно 4 нм [7].

     Остаток пролина, не имеющий водородной связи  на атоме азота, ослабляет спиральную структуру, вызывая изгибы в полипептидной  цепи. Сходные спирали, состоящие  из 6 туров, образуются полипептидами, заключёнными между большой и  малой двойными петлями (малый соединительный фрагмент), с вовлечением первой полупетли малой двойной петли. В этих участках также отсутствуют  остатки пролина.

     Исходя  из изложенного выше, каждый домен  сывороточного альбумина имеет  пять  спиралей: по две в каждой из больших петель и одну в малом  соединительном сегменте. Предполагается наиболее вероятным, что эти спирали  расположены в виде пятигранной  призмы. При этом в пространство, ограниченное пятью спиралями, обращены гидрофобные группировки. У одного из оснований призмы сосредоточены  концы спиралей, фиксированные дисульфидными  связями. Противоположная сторона  пятигранника остаётся открытой. Анализ аминокислотной последовательности свидетельствует  о накоплении положительных зарядов  в этих участках [8].

     В настоящее время с полной определённостью  доказано, что стабильность вторичной, третичной и четвертичной структур белка, определяется прежде всего физико-химическими взаимодействиями, обеспечивающими максимальный контакт изологических субъединиц. Было установлено, что укладка полипептидных цепей в нативную структуру начинается с формирования специфического «кармана», стабилизированного гидрофобными взаимодействиями, которые доминируют над остальными нековалентными связями. Кроме того, локальные гидрофобные взаимодействия стабилизируют вторичную структуру белка, что особенно важно для сохранения постоянства свойств описанных спиральных участков [9].

     Описанная геометрическая чёткость расположения полипептидных цепей в пространстве – лишь одна из сторон структурной  организации альбумина. Второй не менее  важной чертой является высокая стерическая  лабильность, лёгкость конформационных  переходов. 

     Изложенная  модель Брауна, а точнее – Брауна – Лозатти, допускает известную  степень свободы. Это проявляется, во-первых, наличием вращательной подвижности доменов по отношению друг к другу; во-вторых, достаточно свободным положением аглобулярных цепей относительно глобулярного центра домена; в-третьих, возможностью объединения спиральных участков цепи не только в пятичленные сочетания, но и в трёхспиральные субъединицы. Последнее допущение связано с наличием двух дополнительных аминокислотных участков в положениях 176 – 197 и 368 – 389 (рисунок 1), объединяющих между собой три домена и состоящих из шести туров α-спирали, как и все другие спиральные образования альбумина. Вступая во временный контакт с двумя спиралями больших петель смежных доменов, эти участки могут формировать трёхгранные образования, имеющие строение, сходное с описанными пятигранниками.

     Современные методы исследования пространственной структуры белка позволили построить  трёхмерную модель структуры альбумина, которая представлена на рисунке 4 [10]. 

     Рисунок 4 –  Трехмерная структура альбумина 
 

     1.2.1 Гетерогенность альбумина 

     Гетерогенность  альбумина разделяют на макрогетерогенность  и микрогетерогенность. Первая связана  с тем, что в организме молекулы альбумина не все являются идентичными и отличаются по сульфгидрильной группе, которая у одних молекул восстановлена, у других нет, по отношению к химическим реагентам. Также в пуле альбумина может наблюдаться наличие мономерной фракции, димерной и т.д., что также является фактором, обуславливающим гетерогенность молекулы альбумина .

     Первоначально учёным удалось выделить две группы молекул альбумина: меркаптоальбумин и немеркаптоальбумин. Первый имеет  восстановленные высокореакционноспособные SH-группы, во втором эти группы не были выявлены. L. Anderson (1966) выделил даже  несколько форм меркаптоальбумина, по-разному чувствительных к действию β-меркапто -этанола. Во многих отношениях эти две формы альбумина идентичны [11].

     Ещё одна форма гетерогенности альбумина  связана с наличием наряду с мономерными  олигомерных (дву-, три- и тетрамерных) форм, которые можно выявить методом  электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата  натрия. Наиболее возможный путь димеризации  заключается в формировании дисульфидных мостов в результате окисления SH-групп  меркаптоальбумина. Было установлено, что такой процесс легко протекает  в кислой среде при наличии  катионов меди. Ионы других металлов (Zn²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Ni²⁺,Cr³⁺) не катализируют реакцию полимеризации [12].

     Однако  механизм образования олигомерных  фракций полностью не выяснен. Димеры альбумина в свою очередь гетерогенны. Только 30 % фракции димера переходит  в мономер при восстановлении SH-групп β-меркаптоэтанолом в нейтральной  среде. Часть димерных фракции расщепляется при низких значениях pH в присутствии  диоксана, додецилсульфата натрия или  гуанидингидрохлорида. Примеси димера и других олигомеров в препарате  альбумина в количественном отношении  широко варьируют: от 5 – 10 до 50% и более. Количественное соотношение олигомеров в препарате альбумина во многом зависит от способа выделения, продолжительности  и условий хранения материала.

     Термин  «микрогетерогенность» был введён J. Colvin и соавт. (1954) [13], считавшими, что каждый белок является популяцией молекул. Развивая это понятие применительно к альбумину, J. Foster и соавт (1965) [14] выявили, что между перечисленными выше разновидностями белка существует множество промежуточных переходных форм (N – F).

     Микрогетерогенность альбумина проявляется также  при изучении тепловой денатурации  белка.

     О гетерогенности альбумина также  свидетельствуют опыты по обратимой  химической денатурации, т.е. различные  представители популяций молекул  альбумина неодинаково реагируют  на присутствие в среде денатурирующего  агента.

     Проявлением микрогетерогенности альбумина  является также неодинаковая растворимость  отдельных его субфракций при  специально подобранных условиях.

     Степень гетерогенности и микрогетерогенности, присущей альбумину в норме, возрастает при различных патологических состояниях [15].

     Особое  место в происхождении полиморфизма отводится единственной меркаптильной  группе, принадлежащей, как было отмечено выше, Cys³⁴ . По одним данным эта группа участвует в образовании полимерных форм альбумина. По мнению J.Foster (1977), SH-группа свободно перемещаясь на N-концевой цепи над поверхностью глобулы альбумина, катализирует изомерные превращения дисульфидных мостиков.

     Несмотря  на сравнительно большое количество дисульфидных сшивок, молекула ЧСА  не является совершенно жесткой глобулой. В ней есть достаточно много гибких и подвижных мест. Под действием температуры, рН и даже в результате связывания органических молекул в отдельных местах ЧСА происходят конформационные перестройки. Если изменять величину рН раствора альбумина от 7.4 в кислую сторону, то в области рН 4-5 происходит так называемый переход N-F. Этот переход изменяет общую конформацию глобулы и поэтому регистрируется многими методами. Другой переход происходит при увеличении рН до 7-9 (переход N-B). Он почти не влияет на размеры глобулы ЧСА и был зарегистрирован лишь в результате использования красителей, связывающихся с альбумином [16]. 
 

     1.2.2 Характеристика центров  связывания лигандов  в альбумине 

     Многие  аминокислотные остатки в молекуле альбумина имеют гидрофобную цепочку. В белковой глобуле такие остатки группируются друг с другом, скрываясь от молекул окружающей воды. Образующиеся гидрофобные кластеры, и некоторые из них способны, в свою очередь, связывать плавающие в воде небольшие гидрофобные молекулы – например, бутан, гептан и более длинные углеводороды.

     Подобные  же гидрофобные углеводородные цепочки  содержатся и в молекулах жирных кислот, которые всегда есть в крови. Однако жирная кислота содержит не только гидрофобную цепочку, но и гидрофильную группу СОО^-. Поэтому такая кислота может "спрятать" свою гидрофобную цепочку в гидрофобный кластер альбумина только в том случае, если кластер находится около поверхности глобулы, чтобы группа СОО^- оставалась в полярном окружении (в воде). Таким образом, для жирных кислот и других молекул, имеющих гидрофильные группы, годится далеко не каждый кластер альбумина.

     Группа  СОО^- жирной кислоты при физиологических рН несет отрицательный заряд. Поэтому жирная кислота особенно хорошо должна связываться с такими участками глобулы альбумина, где имеется кластер гидрофобных аминокислот. Этот кластер находится около поверхности глобулы, а на поверхности расположены положительно заряженные аминогруппы остатков лизина или аргинина. В настоящее время установлено расположение четырех таких участков. Они обозначаются как ЖК-1, 2, 3, 4.

     Молекула  билирубина по размеру и по гидрофобности значительно превосходит молекулу жирной кислоты. Связывание билирубина — одна из самых важных функций альбумина. Имеется один участок в глобуле альбумина, связывающий билирубин наиболее прочно. Кроме того, альбуминовая молекула может связывать еще несколько молекул билирубина, но слабее [17].

     Множество различных органических молекул, имеющих гидрофобные группы, способны связываться с альбумином. Одни из них по своей структуре лучше соответствуют одним участкам альбумина, другие – другим. Для количественной характеристики такого соответствия обычно используются два параметра: концентрация участков (центров) связывания (N) и константа связывания (К). Если в раствор альбумина добавить органические молекулы, способные с ним связываться (лиганды), то часть этих молекул свяжется с альбумином, а часть останется в растворе. Жирные кислоты, билирубин, многие метаболиты взаимодействуют с альбумином обратимо: связавшись с альбумином, такая молекула какое-то время находится в центре связывания, а затем уходит из альбумина. Обычно время пребывания молекулы в альбуминовом центре – менее 1 секунды [18].

     Жирные  кислоты и билирубин имеют  самые высокие значения константы  связывания. Другие лиганды, в том числе лекарства и зонды, характеризуются величинами pК, ниже 10⁷ М^-1.

     Молекула  органического лиганда, связавшись с глобулой альбумина, изменяет свойства глобулы. Это регистрируется самыми разными методами, и можно только удивляться, как маленькая молекула массой около 300 Да может так повлиять на глобулу массой около 66.000 Да. В частности, изменяются свойства оставшихся незанятыми центров связывания. В результате константа связывания одного центра зависит от того, какие лиганды связаны с другими центрами той же молекулы альбумина. Эти влияния центров друг на друга называются кооперативностью связывания лигандов. Поэтому нет возможности точно описать свойства центров, и, как правило, данные разных авторов заметно различаются в зависимости от условий проведения опытов и подбора лигандов.

     Глобула альбумина столь лабильна и чувствительна даже к слабым влияниям потому, что каждый центр связывания лигандов формируется благодаря контакту разных участков полипептидной цепи, которые притягиваются друг к другу сравнительно слабыми гидрофобными и Ван-Дер-Ваальсовыми взаимодействиями. Такое взаимодействие легко нарушить, что сразу отразится на большом участке глобулы.

     Наиболее  удобным средством исследования центров связывания в молекуле альбумина  оказалось использование красителей. Вначале это были абсорбционные  красители, но затем все большую  роль стали играть флуоресцентные красители – так называемые флуоресцентные зонды. В дальнейшем стали применять, кроме того, спиновые зонды.

     Самыми  чувствительными индикаторами структурных перестроек в альбумине являются флуоресцентные зонды [19]. 
 

     1.3 Влияние физическо-химических  факторов на альбумин 

     Как было сказано выше, микрогетерогенность  альбумина также проявляется  при изучении тепловой денатурации  белка. S. Stokrova и Sponar установили, что молекулы ЧСА по-разному чувствительны к нагреванию. Боле подробное исследование этого процесса показало, что часть молекул альбумина под влиянием тепла переходит в особое конформационное состояние, приобретая при этом способность защищать исходный нативный альбумин от температурного воздействия. Полагается, что образование такой формы является эволюционным регуляторно-защитным механизмом [20].