Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе

     Влияние рН. Как известно, почти все глобулярные белки подвергаются, воздействию ионов водорода при их достаточных концентрациях. При этом белки могут увеличиваться в объеме, диссоциировать, быстро денатурировать при рК, не очень удаленных от изотонической точки, а некоторые белки, в зависимости от рН среды, могут существовать в нескольких изомерных формах. В этом случае другие изомерные формы не обязательно более беспорядочны, чем структура нативной молекулы. Как правило, все изомерные формы обладают хорошо определенной структурой. Альбумин относится к  числу последних белков.

     Было  установлено, что при снижении величины рН (<3,5), происходит увеличение объема молекул БСА. Это объясняется  явлением кулоновского отталкивания в  результате аномального связывания H⁺ и накоплением положительных зарядов в кислой среде. В 0,15 М растворе NaCl кислотные изменения значительно менее выражаются, хотя в этом случае незначительно увеличивается объём молекулы. При более высоких значениях рН (=4,0) в 0,15 М растворе NaCl происходит некоторое повышение вязкости раствора. Такое состояние было названо экспендабельным, т.е. способным к расширению [21].

     Учёные  M. Sogami и J. Foster разделили кислотные переходы альбумина на ряд стадий: N → F`→ F → E (N – normal, F – fast, эта форма быстрее перемещается в геле сефадекса, E – expanded, т.е. полностью растворённая). Причём стадии N → F`→ F являются обратимыми, а E – необратимой. Разделение стадий на F`и F обусловлено неравномерным ходом процесса деспирализации альбумина в кислой среде. В интервале величин pH от 4,5 до 3,7 α-спиральность снижается с 51 до 44%. Затем процесс несколько стабилизируется (F`). Далее при pH 3,5 – 3,0 спиральность вновь снижается до 35%. При этом изменяются физико-химические свойства альбумина. В частности, F-форма значительно хуже растворима в концентрированных солевых растворах, чем N-форма. Предполагается, что N – F переход сопровождается раскрытием гидрофильных поверхностей белковой молекулы. Затем (F`→ F) – открываются гидрофобные зоны [21].

     По  данным A. Wishnia и T. Pinder, F-форма лишена присущей N-альбумину способности  связывать алканы. Это положение  свидельствует о необходимости  наличия гидрофобных щелей в  молекуле, в которые внедряется молекула лиганда. Исчезновение таких полостей при раскрытии гидрофобных зон  в F-форме приводит к утрате способности  белка фиксировать неполярные молекулы.

     В диапазоне pH 6,0 – 8,0 конформационные переходы альбумина сопровождаются изменением микроокружения аминокислотных остатков триптофана, тирозина, гистидина. При повышении рН в дипазоне от 7,0 до 9,0 происходит N – B-переход молекулы, в результате которого повышается  доступность имидазольных остатков, скрытых в N-форме. N – B-переход молекулы альбумина сопровождает pH-зависимое связывание нестероидных противовоспалительных соединений, гепариновых антикоагулянтов и т.д. [22].  
 

     1.3.1 Влияние химических модификаторов на альбумин 

       В организме молекула альбумина подвергается различным модификациям, причем при патологии степень модификации может возрастать во много раз. Один из видов модификации - это присоединение остатка глюкозы к лизину (No 525). У здоровых людей гликозилировано в среднем несколько процентов всех молекул альбумина, а при диабете – в 1.6 – 2.5 раза больше[23].

     Одним из химических веществ, наиболее часто  применяемых для денатурации  глобулярных белков, является водный раствор мочевины. До сих пор точно не установлены ни механизм ее денатурирующего действия, ни природа происходящих в белке изменений структуры. В течение длительного времени денатурирующее влияние мочевины связывали с ее способностью образовывать водородные связи, разрывающие внутримолекулярные водородные связи белка. Однако после, было доказано, что метилзамещенная мочевина или аммониевые соли являются менее эффективными денатурантами, несмотря на их большую способность образовывать водородные связи. К тому же, если это было бы так, то сама вода могла бы быть эффективным денатурирующим агентом [24].

          Другие исследования, имеющие дело  с растворимостью углеводородов  и аминокислот в растворах  мочевины, показали, что влияние  мочевины на нативную конформацию  белков может быть приписано дестабилизации гидрофобных связей. Это объясняется тем, что в растворах мочевины неполярные группы находятся в энергетически менее выгодном окружении, чем в чисто водных растворах. Денатурирующее действие мочевины было объяснено также на основе предположения о ее  катионной структуре. Наиболее удивительным в денатурирующем действии мочевины является то, что, несмотря на полное, как считается, разрушение пространственной структуры, белки в водной среде остаются в растворенном состоянии [25].

     Для большинства белков действие мочевины проявляется в увеличении размеров молекулы и уменьшении количества вторичных структур: α-спиралей и β-структур. В этом плане сывороточный альбумин не является исключением. Обнаружено, что в растворе мочевины при концентрации больше, чем 2 М, увеличивается левовращение и вязкость сывороточного альбумина. При этом также изменяется УФ-спектр поглощения белка. Все эти изменения обратимы, что объясняется специфическим расположением дисульфидных мостиков в молекуле альбумина. Левовращение молекулы альбумина в растворе 8М мочевины (при 20°С, рН 6,3) увеличивается, степень β-спиральности ее уменьшается почти в 2 раза, что указывает на обширную дезорганизацию нативной структуры белка. При этом характеристическая вязкость этого белка возрастает от 4 до 17 мл/г, а радиус инерции молекулы, определенный рентгенографическим исследованием увеличивается. Кроме того, если в нативной форме альбумин имеет 3 доступных к восстановлению дисульфидных  мостика, то в  присутствии 8М мочевины восстанавливаются все дисульфидные связи [26].

     Интересно отметить, что рН системы сильно влияет на процесс денатурации. Например, характеристическая вязкость альбумина  в растворе 8 М мочевины при рН 10,5 почти в 2 раза больше, чем при  рН  7,4.  Кроме того величина изменения  как оптического вращения так и характеристической вязкости зависит от температуры системы. В интервале температур от 0 до 40°С с повышением температуры действие, вызванное мочевиной подавляется. Ниже 40°С процесс денатурации является обратимым по отношению к изменению температуры и концентрации мочевины, выше 40°С происходит необратимое изменение структуры альбумина которое имеет место при более низких концентрациях денатуранта [27]. 

     Несмотря на явное увеличение размеров молекулы, о чем свидетельствует четырехкратное увеличение вязкости и доступности его дисульфидных связей в растворах 8 М мочевины, белок не только остается в растворенном состоянии, но, как показали Ноли, Маркус и другие, не образует агрегированных форм. Последнее указывает, что тиольная группа, которая, как правило, является причиной образования агрегатов в растворах альбумина, остается стерически недоступной, как и в нативной форме. Из этого следует, что полного разрушения структуры молекулы альбумина в 8М  мочевине не происходит, о чем свидетельствует также и сохранение половины спиралей и небольшое, всего в 1,5 раза, увеличение радиуса инерции молекулы [28].

     Обобщая все эти факты, можно прийти к выводу, что природа изменений структуры альбумина в растворе 8 М мочевины до последнего времени остается непонятной. Однако использование метода тритиевой метки, позволяющего определить, как качественно, так и количественно, доступную поверхность молекулы белка в разных его структурных состояниях, дало более детальную информацию о происходящих изменениях в структуре альбумина при его взаимодействии с 8 М мочевиной[29].

     В растворе 8 М мочевины распределение тритиевой метки по аминокислотным остаткам ЧСА отличается от нативного, обнаруживая увеличение доступности (радиоактивности) для целого ряда остатков: Arg, Asp, Ser, Pro, Gly, Ala. Наибольшими изменениями, почти в 3 раза, характеризуются остатки Arg и Gly [30].

     Увеличение  доступности аминокислотных остатков вполне закономерное явление, которого и следовало ожидать исходя из совокупности данных по влиянию мочевины. Известно, что даже в тех случаях, когда в присутствии 8 М мочевины не наблюдается заметных изменений структуры, фиксируемых по вязкости и оптическому вращению. Наблюдается, однако, уменьшение доступности дисульдных связей для меркаптэтанола[31].

     Применяя  предлагаемый подход определения площади  полной доступной поверхности белковой глобулы, можно оценить и полную доступную поверхность молекулы ЧСА в растворе 8 М мочевины, которая составляет 57300 А [32].

       Таким образом, в растворе 8М  мочевины полная доступная поверхность  молекулы ЧСА увеличивается от 39000 (для нативного белка) до 57300 А.  Известно, что характер изменения доступности остатков и полной доступной поверхности молекулы ЧСА не согласуется с четырехкратным увеличением вязкости раствора этого белка в присутствии 8 М мочевины. В самом деле, хорошо видно, что, во-первых масштаб изменений не велик, так как полная доступная поверхность молекулы увеличивается всего в 1,45 раза, а, во-вторых, доступность гидрофобных остатков увеличивается очень не существенно, от 19900 А до 24900 А – всего в 1,25 раза, тогда как признаком развертывания является превалирующее экспонирование растворителю гидрофобных остатков[33].

     Можно прийти к выводу, что увеличение вязкости может быть следствием изменения  формы молекулы, то есть увеличение асимметрии, и появления у нее дополнительной гибкости в результате разрушения гидрофобных связей. Слабое увеличение доступности гидрофобных остатков связано, в первую очередь, с тем, что в нативной структуре, они уже обладают повышенной доступностью тритию [34].

     Слабое  влияние мочевины на структуру альбумина  хорошо согласуется с фактом устойчивости этого белка к действию мочевины. Эта закономерность прослеживается даже при нагревании ЧСА до 44°С. Интересно, что в растворе 8 М мочевины совсем по другому ведут себя другие глобулярные белки. Например, по данным, полученным Волынской методом тритиевой метки, изменение структуры лизоцима в растворе 8М мочевины характеризуется четырехкратным увеличением суммарной доступности остатков. Причем гидрофобные остатки увеличивают доступность в 7 раз при неизменности гидрофильных остатков. Это означает, что характер конформационных изменений заметно различается для сывороточного альбумина и лизоцима. По-видимому, наблюдаемое влияние мочевины на структуру альбумина обусловлено особенностями пространственной организации этого белка. Действительно, было доказано, что альбумин, по сравнению с лизоцимом, характеризуется низким коэффициентом свернутости нативной структуры и высоким коэффициентом шероховатости поверхности. По физическому смыслу коэффициент свернутости означает долю поверхности всей полипептидной цепочки, которая исчезает при свертывании ее в нативную структуру. Коэффициент шероховатости дает представление о рельефности поверхности, и очевидно, что большая величина его свидетельствует о большой изрезанности поверхности, наличием на ней складок, щелей карманов и петель. Поэтому влияние мочевины, по всей вероятности, обусловлено именно наличием таких неплотно упакованных участков в структуре белка, которые, вероятно, локализованы в интерфазах субъединиц. Возможно, что действие мочевины в существенной степени сводится к расширению молекулы в результате разъединения субъединиц. Поэтому, в отличие от лизоцима, структурные изменения в альбумине могут носить локальный характер и не затрагивать в значительной степени всю молекулу. Другими словами, деформация молекулярной структуры при не очень больших воздействиях может локализоваться именно в неплотноупакованных участках, не приводя к полному разрушению структуры [35].

     Значительным  структурным изменениям молекулы альбумина, по-видимому, препятствует также система  S-S-связей, расположенных регулярно по всей длине полипептидной цепи[36].

     Надо  отметить, что на денатурацию альбумина  мочевиной немало влияют и связанные  с ним жирные кислоты, Катцом и Денисом показано, что обезжиренный альбумин более чувствителен к такой денатурации, чем альбумин с жирными кислотами. Удаление жирных кислот увеличивает скорость денатурации так, если денатурация обезжиренного белка происходит в течение 5-10 минут, то для необработанного альбумина требуется 30-60 минут. По-видимому, присутствие в альбумине жирных кислот не только уменьшает скорость денатурации белка при его взаимодействии с 8М мочевиной, но и препятствует обширным изменениям его структуры [37].  

       1.4 Функции сывороточного альбумина в организме человека 

     Альбумин  выполняет в организме ряд  функций, имеющих важное значение для  поддержания гомеостаза внутренней среды всего организма. Их нарушение  играет роль в патогенезе многих критических  состояний организма человека[38].

     В норме молекулы альбумина обеспечивают 80—85% онкотического давления плазмы. Это происходит вследствие низкой проницаемости стенки капилляров для молекул альбумина, которые содержат большое количество заряженных групп, удерживающих воду. При критических состояниях проницаемость эндотелия увеличивается и онкотическое давление падает. При некоторых заболеваниях (острой почечной недостаточности, циррозе печени, гемолитической болезни и др.) способность молекул альбумина связывать воду изменяется, и это тоже может оказывать влияние на онкотическое давление плазмы [39].

     Альбумин  обратимо связывает и переносит самые разнообразные низкомолекулярные вещества: метаболиты, среди которых жирные кислоты, желчные пигменты, окись азота, холестерин, металлы как постоянной (Zn²⁺, Са²⁺), так и переменной валентности (Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺) и очень многие лекарственные препараты. Тестирование лекарственных средств на способность связываться с ЧСА является обязательным этапом их испытаний. Число молекул лигандов, которое одновременно способна удержать 1 молекула ЧСА, может достигать 10 и более. Примерно 1 литр плазмы может нековалентно связать более 1 грамма лиганда с молекулярной массой около 350 Да [40].

     При связывании лиганда с альбумином химическая и биологическая активность этого лиганда меняется. Многие вещества, токсичные в свободной, несвязанной форме значительно снижают свою активность при связывании с ЧСА. Это особенно важно при таких состояниях, как полиорганная недостаточность, циркуляторный шок и т. п., когда функции печени и почек ослаблены. Таким образом, альбумин является важным звеном в системе детоксикации организма.