Стерильность пыльцы некоторых тест - растений, как показатель качества среды

Методика заключается в следующем. Пыльник кукурузы просветляют в 10 %-ном растворе едкого калия и при необходимости фиксируют в уксусном алкоголе 3:1. Крахмал выявляют в растворе хлоралгидрата (5 г хлоралгидрата смешивают с 2 мл воды, затем добавляют кристаллический йод до насыщения) или используют йодид калия с металлическим йодом (в 100 мл воды растворяют 3 г йодида калия и затем 0,2 г йода). Предложен метод заключения пыльцы в агаре, что удобно в цитологической практике [21]. Для этого 1 г агара растворяют в 50 мл воды и кипятят 3 минуты. В агар добавляют 6 мл йодного раствора (0,3 г йода и 1 г иодида калия в 100 мл воды) и 14 мл 1 н. НCl. В такой теплый раствор помещают пыльцевые зерна на предметном стекле и накрывают покровным стеклом.

 

1.3.2 Методы определения жизнеспособности пыльцы

 

Известно несколько методов  определения жизнеспособности пыльцы в лабораторных условиях. Пыльцу либо проращивают на искусственной среде во влажной камере, либо определяют наличие в ней ферментов, связанных с жизненными процессами.

Проращивание пыльцы в камере Ван-Тигема. Камеру Ван-Тигема легко приготовить. Для этого стеклянную трубку диаметром 10-12 мм режут на кольца длиной 5-7 мм. Кольцо с отшлифованными краями приклеивают парафином в центре предметного стекла. Верхние края кольца смазывают вазелином. Внутрь кольца на дно наносят каплю воды. Кольцо закрывают покровным стеклом, в центр которого помещена капля искусственной среды с пыльцой.

Для приготовления искусственной  среды агар-агар заливают в колбе  небольшим количеством воды для набухания, а затем колбу ставят на теплую водяную баню. Когда агар-агар растворится, добавляют сахарозу. В 100 мл готового раствора должно быть растворено 1 г агар-агара и 5-40 г сахарозы (в зависимости от объекта). Для гороха, кукурузы, картофеля и других растений используют 10-15 % раствор сахарозы [22].

На чистое покровное стекло наносят  каплю горячей искусственной среды и сверху быстро сеют пыльцу. Ее предварительно набирают пинцетом, который держат в левой руке. Другой рукой берут скальпель, которым слегка ударяют сверху по пинцету, чтобы равномерно посеять пыльцу. Покровное стекло переворачивают и накрывают им кольцо камеры Ван-Тигема. Пыльца оказывается внутри влажной камеры.

Камеры переносят в термостат  с температурой 20-30 °С. Через каждый час пыльцу нужно просматривать под микроскопом, чтобы установить начало ее прорастания. Подсчитывают прорастающие пыльцевые зерна в 5-10 полях зрения. Процент жизнеспособной пыльцы устанавливают по числу проросших пыльцевых зерен. Пыльцевые трубки должны иметь длину не меньше диаметра пыльцевых зерен. Удобным объектом для проращивания пыльцы в камерах Ван-Тигема является примула [4].

При проращивании пыльцы кукурузы можно  добавлять к питательной среде  свежий куриный желток [23]. Среду готовят из 1 %-ного агар-агара и 17 %-ной сахарозы. На 10 мл этой среды добавляют 1 каплю желтка. На дно камеры помещают 0,5 см² влажной фильтровальной бумаги. Проращивают пыльцу при 24-26 °С.

Проращивание пыльцы методом Д.А. Транковского. При этом методе в качестве влажных камер используют бактериологические чашки с увлажненной фильтровальной бумагой или стеклянные колпаки. Искусственную среду, состоящую из 1 %-ного агар-агара и тростникового сахара различной концентрации, наносят на предметное стекло. На эту среду высевают пыльцу из зрелых пыльников. Затем предметные стекла помещают во влажную камеру. Проросшие пыльцевые зерна фиксируют по Навашину с добавлением в фиксатор тростникового сахара в такой же концентрации, как в искусственной среде, или несколько больше. Через 2-3 минуты препараты переносят в свежий фиксатор на 1-1Ѕ часа, затем промывают водой, протравливают железоаммонийными квасцами, окрашивают гематоксилином по Гейденгайну, обезвоживают в спирте, заключают в ксилол и бальзам.

В.А. Поддубная-Арнольди использовала для окраски пыльцевых трубок на искусственной среде ацетокармин  и фиксацию по Карнуа с последующей  окраской гематоксилином по Делафильду или Эрлиху.

Некоторые исследователи, чтобы изучить  действие облучения на пыльцу и накопить метафазы при исследовании митозов  в пыльцевых трубках, добавляют  в искусственную среду колхицин 0,05 %-ной концентрации, или в чашки Петри, в которых находятся препараты с проросшей пыльцой, помещают кристаллы аценафтена. Пары аценафтена ингибируют веретено деления.

Оба рассмотренных метода проращивания пыльцы на искусственной среде во влажных камерах пригодны не для  всех культур, так как могут  давать заниженные результаты. Для успешного проведения работы необходимо следить за стерильностью посуды и растворов.

Определение жизнеспособности пыльцы методом В.С. Шардакова. Метод основан на выявлении фермента пероксидазы в жизнеспособных пыльцевых зернах. Непосредственно перед исследованием готовят четыре свежих раствора, которые помещают в темную посуду:

А – 0,20 г бензидина основного растворяют в 100 мл 50 %-ного этилового спирта;

Б – 0,15 г α-нафтола растворяют в 100 мл 50 %-ного этилового спирта;

В – 0,25 г углекислого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды;

Г – 0,3 %-ный раствор перекиси водорода (в капельнице) .

Первые три раствора (А, Б, В) перед  началом работы смешивают в равных объемах и наливают в капельницу. Пыльцу помещают на предметное стекло в каплю этой смеси и добавляют каплю перекиси водорода. В присутствии бензидина живая пыльца, содержащая пероксидазу, окрашивается в ярко-розовый или темно-красный цвет. Погибшая пыльца не окрашивается.

В.Н. Юрцев указывает, что этот метод  дает завышенные результаты при исследовании хранившейся пыльцы.

Определение жизнеспособности пыльцы методом П.И. Диакону. Этот метод был разработан в ТСХА. О жизнеспособной пыльце судят по наличию активных дыхательных ферментов дегидрогеназ, в присутствии которых бесцветный раствор 2,3,5-трифенилтетразола хлористого восстанавливается в формазан ярко-красного цвета. Погибшие пыльцевые зерна остаются бесцветными.

Необходимы следующие растворы:

1. 1/15М раствор Na₂HPО₄·2H₂О;
2. 1/15М раствор КН₂РО₄;
3. фосфатный буфер Сёренсена (рН 7,17); для его получения соединяют 70 мл 1/15 М раствора Na₂HPО₄·2H₂О и 30 мл 1/15 М раствора КН₂РО₄;
4. 0,5-0,1 %-ный раствор 2,3,5-трифенилтетразола хлористого в 1/15М фосфатном буфере Сёренсена с рН 7,17 (в качестве буфера используют раствор 3.

Пыльцу помещают в 1-2 капли раствора 4, накрывают покровным стеклом и ставят в термостат при 37 °С на 20-30 минут. Под микроскопом просматривают 5 полей зрения в каждом из 3-5 препаратов. Окрашенные в красный цвет пыльцевые зерна относят к жизнеспособным.

Метод дает четкие результаты при  работе с многими сельскохозяйственными  культурами [4].

Таким образом, рассмотренные нами методы изучения жизнеспособности и  фертильности пыльцы говорят о точности оценки и простоте проведения биологического мониторинга с помощью пыльцы тест-растений.

 

 

2 ОБЪЕКТ, ПРОГРАММА И МЕТОДИКА  ИССЛЕДОВАНИЙ

 

 

Объектом исследования является пыльца растений.

Цель исследования – изучить  пыльцу некоторых тест-растений на предмет стерильности.

Программа исследований включала следующие  задачи:

1. Освоить методику определения стерильности пыльцы.
2. Определение стерильности пыльцы некоторых растений в районе УНБ «Ченки» и вдоль ул. Советская в районе университета.

Методика исследований:

В качестве растений биоиндикаторов нами были выбраны следующие представители:

Конский каштан обыкновенный (Aesculus hippocastanum L.)

 

отдел покрытосеменные – Magnoliophyta (Angiospermae);

класс двудольные – Magnoliopsida (Dicotyledoneae);

   порядок сапиндоцветные – Sapindales;

      семейство конскокаштановые – Hippocastanaceae;

          род конский каштан

 – Aesculus;

            вид конский каштан обыкновенный – Aesculus hippocastanum L. [24]

 

Листопадное дерево с прямостоячим типом побега. Листорасположение  – супротивное, листья располагаются  ближе к верхушке. Листья сложного типа, пластинка имеет округлую форму, членение – пальчатое. Прикрепление – черешковое, форма долей листьев ланцетная, обратнояйцевидная, членение отсутствует. Верхушка округлая, острая, оттянутая, края зубчатые, основание клиновидное. Соцветие  –  кисть, метелка. Основной цвет цветков – белый, имеются оттенки красного, размер 1-2 см. Околоцветник актиноморфный, число лепестков равно 5. Тип плодов коробочка, орех окрашен с оттенками бурого и зеленого, имеются придатки в виде колючек или острых выступов. Местообитание обочина дорог, парки, сады, широколиственные леса. Цветет в мае [].

 

Чистотел большой (Chelidonium majus L.)

 

отдел покрытосеменные – Magnoliophyta (Angiospermae);

класс двудольные – Magnoliopsida (Dicotyledoneae);

   порядок макоцветные– Papaverales;

      семейство маковые – Papaveraceae;

          род  чистотел

 – Chelidonium;

              вид чистотел большой – Chelidonium majus L. [24]

 

Многолетняя, длиннокорневищная трава  с прямостоячим типом побегов. Листорасположение  – очередное, листья располагаются  у основания или в прикорневой розетке. Листовая пластинка имеет овальную или эллиптическую форму, членение – перистое, рассеченное. Прикрепление – сидячее (у верхних листьев), черешковое. Форма долей листьев обратнояйцевидная, овальная, округлая, удлиненная, яйцевидная, членение отсутствует. Верхушка округлая, края городчатые, зубчатые, основание округлое. Соцветие – зонтик. Основной цвет цветков – желтый, размер 2-5 см. Околоцветник – актиноморфный, число лепестков равно 4. Тип плодов коробочка, стручок или боб. Местообитания газон, залежь, обочина дороги, парки или сад, пашня или огород, пустырь, берег реки лили ручья, скалы, опушки лесов. Цветет мая по август. [24]

 

Лютик едкий (Ranunculus acris L.)

 

отдел покрытосеменные – Magnoliophyta (Angiospermae);

класс двудольные – Magnoliopsida (Dicotyledoneae);

   порядок  – Ranunculales;

      семейство лютиковые

 – Ranunculaceae;

          род лютик – Ranunculus;

              вид лютик едкий – Ranunculus acris L. [24]

 

Многолетняя, розеточная трава, с прямостоячим типом побегов. Листорасположение – очередное, листья располагаются у основания или в прикорневой розетке. Листья простого типа, пластинка имеет округлую, обратнояйцевидную форму, членение – пальчатое, рассечение тройчатое. Прикрепление – сидячее, форма долей листа ланцетная, линейная, ромбическая, удлиненная, членение – перистое. Верхушка острая, края гладкие, основание выемчатое, сердцевидное. Соцветие – зонтик. Основной цвет цветков – желтый, размер 1-2 см. Околоцветник актиноморфный, число лепестков равно 5. Тип плодов орешек, многоорешек. Место обитания газон, обочина дороги, парк или сад, пустырь, берега озер и рек, леса, луга. Цветет в июне.

 

Вьюнок полевой (Convolvulus arvensis L.)

 

отдел покрытосеменные – Magnoliophyta (Angiospermae);

класс двудольные – Magnoliopsida (Dicotyledoneae);

     порядок  – Convolvulales;

         семейство  вьюнковые

 – Convolvulaceae;

             род вьюнок

– Convolvulus;

                 вид вьюнок полевой – Convolvulus arvensis L. [24]

 

Многолетняя, лианообразная трава, с вьющимся, лежачим типом побега. Листорасположение – очередное, размещение листьев по длине стебля. Листья простого типа, пластинка имеет овальную, удлиненную форму, членение отсутствует. Прикрепление – черешковое, верхушка острая, края гладкие, основание сердцевидное, стреловидное. Соцветие – кисть. Основной цвет цветков – белый, розовый, имеются оттенки красного, размер 2-5см. Околоцветник – актиноморфный, число лепестков равно 5. Тип плодов коробочка. Место обитания газон, залежь, обочина дороги, парки и сады, пашни, пустырь, луг. Цветет в июне. [24]

Отбор цветков тест-растений проводили  в период цветения таковых в пригороде  г.Гомеля (вблизи УНБ “Ченки”) и вдоль ул. Советской в районе университета. Было собрано по 20-30 цветков каждого вида. После чего бутоны были зафиксированы в 70% этиловом спирте.

 Изучение жизнеспособности  пыльцы проводили по йодному  методу. В основе метода лежит  определение крахмала при помощи  йодной реакции. Стерильная и  фертильная пыльца растений отличается  по содержанию крахмала. Фертильные  пыльцевые зерна целиком заполнены крахмалом, а стерильные – его не содержат или имеют только следы крахмала. При действии раствора йода, фертильные пыльцевые зерна окрашиваются в коричневый цвет, а стерильные совсем не окрашиваются или окрашиваются фрагментарно (рисунок 1).

 

 

Рисунок 1 – Пыльца лютика едкого после  окраски йодным методом

 

После фиксации бутоны цветков препарировали  на предметном стекле. Тычинки отделяли от всех элементов цветков с помощью  пинцета и препарировальной иглы, раздавливали пыльник и помещали в каплю йодного раствора, затем накрывали покровным стеклом. Через 2-3 минуты приготовленный препарат микроскопировали.

В каждом препарате просматривали 50-100 пыльцевых зерен. Для каждого  растения опыт повторяли 10 раз.

Стерильность  пыльцевых зерен определяют в процентах от их общего количества по формуле 1:

 

                                                     (1)

где М – уровень  стерильности пыльцы, в процентах 

G – количество  стерильных пыльцевых зерен; 

N – общее  количество подсчитанных пыльцевых зерен.

 

Затем определяется ошибка подсчета (формула 2):

 

                                                   (2) 

                         

при этом должно выполняться условие 3m < М.

Поскольку индикаторные виды растений характеризуются разными уровнями спонтанной стерильности пыльцы, которая встречается в экологически чистых – комфортных условиях (П_комф) и различными уровнями повреждения гамет в критических условиях (П_крит), виды индикаторы подразделяются на пять классов: 1 - высокоустойчивые; 2 - устойчивые; 3 - среднестойкие; 4 – чувствительные, 5 – высокочувствительные (таблицы 1). Характеристика этих классов необходима для определения условных показателей поврежденности клеток пыльцы или индикаторных растений по цитогенетическому статусу и дальнейшей интегральной оценки состояния окружающей среды.

 

Таблица 1 – Характеристика фитоиндикаторов  разных групп стойкости по показателю "Стерильность пыльцы"

 

№ группы	Характеристика группы  стойкости (чувствительности)	Стерильность пыльцы, %
		Пкомф	Пкрит
1	Высокоустойчивые	0,2 ± 0,14	10,0 ± 0,95
2	Устойчивые	0,5 ± 0,22	20,0 ± 1,26
3	Среднестойкие	1,0 ± 0,30	30,0 ± 1,45
4	Чувствительные	1,5 ± 0,38	40,0 ± 1,55
5	Высокочувствительные	2,0 ± 0,44	50,0 ± 1,58