Стерильность пыльцы некоторых тест - растений, как показатель качества среды

По данным полинологов [6-8], экзина состоит из трех слоев: наружный слой – сэкзина, часто имеющий скульптурные утолщения, следующий за ним слой – нэкзина, и самый внутренний слой называется эндоэкзиной или мезиной. В экзине имеются отверстия – поры или бороздки, через которые обеспечивается тесная связь пыльцевых зерен с окружающей средой. Величина пор, их форма и количество отличаются у различных видов покрытосеменных растений и часто обусловливаются особенностями структуры экзины. Так, у видов с тонкой и гладкой экзиной пыльца имеет небольшое количество пор (одну, реже три), у видов с толстой, шероховатой, шиповатой экзиной число пор доходит до 30-40, но чаще бывает от 3 до 20. Поры бывают выпуклые, вогнутые, крупные, мелкие.

Удлиненные поры называются бороздками, по краям образуются валики, которые  в сухую, жаркую погоду смыкаются и предохраняют пыльцу от потери воды (у лилейных).

Внутренняя оболочка (интина) представляет собой очень тонкую двухслойную  пленку, состоящую обычно из целлюлозы  и пектиновых веществ; иногда она  бывает несколько утолщенной в местах отверстий экзины (в районе пор или бороздок).

Вслед за формированием оболочек пыльцевого зерна начинается деление первичного ядра микроспоры, которое всегда происходит в пыльниках за несколько дней до раскрытия цветка. Веретено в  метафазе в отличие от обычного митоза образуется на разных полюсах асинхронно: полюс, находящийся ближе к стенке клетки (генеративный), развивается медленнее противоположного (вегетативного) полюса, где имеется значительное количество цитоплазмы. Это различие во времени образования полюсов веретена в метафазе часто вызывает асимметрию веретена. Симметрично построенное веретено наблюдается реже и описано у растений, микроспоры которых не имеют ясно выраженных вакуолей [9].

Во время поздней анафазы  из веретена деления формируется  фрагмопласт и на экваторе, между двумя ядрами, закладывается клеточная стенка. Последняя из-за смещения ядра к стенке клетки вследствие развившегося вакуома обычно проходит ближе к одной из сторон пыльцевого зерна, отчего и возникают две неравноценные по величине клетки.

Длительность  митоза первичного ядра в пыльцевом  зерне зависит как от условий  среды (температуры, влажности воздуха), так и от характера питания  микроспор, от особенностей развития тапетума пыльника, в результате которого в  основном формируются микроспоры и пыльцевые зерна.

Длительность отдельных фаз  митоза в период гаметогенеза (в  пыльцевых зернах традесканции, при  температуре 30 °С) следующая: профазы от 30 до 34 часов, из этого времени наибольшая часть приходится на раннюю профазу; метафазы 0,5 часа; анафазы 0,5 часа; телофазы 0,2 часа. При этом митоз длится от 31,2 до 35,2 часа [10].

Процесс деления первичного ядра в  пыльцевом зерне завершается  цитокинезом, в результате которого образуются две клетки: большая, с  крупным, круглым, несколько рыхлым ядром, крупным ядрышком и жидкой вакуолизированной цитоплазмой, называемая вегетативной клеткой, и меньшая по размеру, с более плотным ядром, богатым ДНК, имеющая густую цитоплазму с высоким содержанием РНК, называемая генеративной клеткой. Специфика в строении этих двух клеток пыльцевого зерна обычно проявляется вскоре после их формирования. Вначале генеративная клетка одной из своих сторон плотно прижата к стенке пыльцевого зерна, однако по мере своего развития она углубляется внутрь полости пыльцевого зерна и приобретает веретенообразную форму. При этом поверхность соприкосновения генеративной клетки со стенкой пыльцевого зерна уменьшается, она отходит от стенки и располагается в цитоплазме вегетативной клетки. Это положение наилучшим образом обеспечивает ее рост и развитие за счет вегетативной клетки. Отличия в характере обмена веществ вегетативной и генеративной клеток определяют особенности их формирования и дальнейшую судьбу. На последующих этапах развития пыльцевого зерна генеративная клетка делится, образуя два спермия [3].

Замечено, что форма генеративной клетки в пыльцевом зерне в  процессе ее онтогенеза меняется от округло-шаровидной, чечевицеобразной, линзовидной до более или менее линейной (вытянутой). Генеративная клетка имеет очень тонкую оболочку в виде двойной мембраны, что благоприятствует обмену веществ между вегетативной и генеративной клетками. Прозрачная оболочка генеративной клетки благодаря высокому показателю преломления бывает легко различима, на фиксированных препаратах она не дает реакции на целлюлозу и состоит из пектиновых веществ [4].

Количество цитоплазмы в генеративных клетках у покрытосеменных растений очень изменчиво, поэтому различают многоплазменные и малоплазменные генеративные клетки. Среди форменных включений в них обычно имеются пластиды (лейкопласты, реже хлоропласты), митохондрии и рибосомы. Цитоплазма вегетативной клетки богата запасными веществами, из которых наиболее распространены липиды, полисахариды (крахмал), аминокислоты, нуклеиновые кислоты (РНК), белковые кристаллы, витамины.

Развитие генеративной клетки у  ряда однодольных растений было обстоятельно изучено на живом материале при культуре пыльцевых трубок на искусственных питательных средах. Было исследовано также развитие мужского гаметофита на фиксированном материале у значительного числа представителей двудольных растений. У одних покрытосеменных растений формирование мужского гаметофита заканчивается в пыльцевой трубке, у других – в пыльцевом зерне. Однако чаще образование мужских гамет – спермиев, так называемый спермиогенез, происходит при прорастании пыльцы в пыльцевой трубке. Этим объясняется, что зрелые пыльцевые зерна у большинства покрытосеменных бывают двуклеточными.

Ядро генеративной клетки в пыльцевой  трубке делится по типу обычного митоза, однако этот вопрос до настоящего времени  остается дискуссионным, поскольку  одни исследователи считают, что при делении генеративного ядра может не наблюдаться образование веретена, тогда как другие доказывают его присутствие.

При изучении митоза в пыльцевой  трубке у некоторых растений наблюдается  слабое развитие веретена в метафазе [9], у других же растений (у тюльпанов, лилий) веретено хорошо выражено. Протопласт генеративной клетки делится клеточной перегородкой, закладывающейся в телофазе митоза, но иногда цитокинез не происходит и образуется двухъядерная генеративная клетка, как у некоторых видов ореха [12, 13].

Как уже было отмечено, у некоторых  растений (семейства сложноцветные, леновые, злаковые и др.) спермиогенез происходит в пыльниках до наступления  цветения. В последнем случае к  моменту раскрытия цветков в  зрелых пыльцевых зернах уже имеются  готовые мужские гаметы – спермии. Трехклеточный тип образования пыльцы, по мнению большинства ботаников, является более прогрессивным по сравнению с двуклеточным.

Проблема изучения структуры спермиев у покрытосеменных растений неоднократно привлекала внимание многих исследователей как у нас, так и за рубежом [8, 12, 14].

Большая заслуга в изучении развития и строения мужского гаметофита принадлежит  Финну, установившему, что мужской  гаметофит у покрытосеменных  растений развивается всегда с образованием спермиев-клеток. Финн в 1940 г. опубликовал сводку по структуре спермиев-клеток. На основании капитальных исследований и работ цитологов его школы описаны спермии-клетки у 245 видов растений, принадлежащих к 70 различным семействам.

В зависимости от количества цитоплазмы, окружающей ядра мужских гамет, спермии могут быть многоплазменными и малоплазменными. Форма и величина спермиев независимо от места их возникновения (в пыльцевом зерне или в пыльцевой трубке) у различных видов покрытосеменных растений также сильно варьируют. По форме спермии могут быть округлыми, овальными, линзовидными, эллиптическими, веретенообразными, спиралевидными, червеобразными и т.д. Форма спермиев претерпевает изменения и в процессе их онтогенеза. Молодые спермин имеют более округлую, а зрелые – удлиненную форму. Спермии бывают мелкие, средние и крупные; так, для двудольных типичны мелкие, реже средние спермии, для однодольных – крупные и средние [4].

По мнению некоторых эмбриологов [6, 12, 14, 15], ядра спермиев до самого конца своего формирования сохраняют телофатическое состояние. Зрелые пыльцевые зерна содержат углеводы (сахара, крахмал), липиды, белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, ферменты (цитохромоксидазу, пероксидазу и др.), витамины, каротиноиды, гетероауксины, минеральные соли, сульфгидрильные соединения. Применение гистохимических методов при изучении зрелой пыльцы у 70 видов покрытосеменных (принадлежащих к 41 семейству) выявило чрезвычайную изменчивость в содержании запасных и физиологически активных веществ не только в пределах одного и того же вида, но и одного и того же пыльника, что свидетельствует о разнокачественности пыльцы. Как и следовало ожидать, наиболее сильно проявляется гетерогенность пыльцы у гибридных форм [6, 16].

Сравнительные исследования пыльцы пшенично-пырейных гибридов показали, что пыльца стерильных гибридов первого поколения отличается значительным снижением активности физиологических процессов, тогда как пыльца фертильных пшенично-пырейных гибридов по интенсивности гистохимических реакций сходна с пыльцой исходных родительских видов – пшеницы и пырея [7].

Количество пыльцы в пыльниках  многих покрытосеменных растений (особенно анемофильных) бывает исключительно  обильным. Так, одно растение кукурузы в среднем производит до 50 000 000 пыльцевых зерен, а пыльца рогозов в Индии используется для изготовления хлебных и кондитерских изделий [17].

Продолжительность жизнеспособности пыльцы у отдельных видов покрытосеменных  растении отличается значительной амплитудой колебания. У одних видов пыльца теряет способность к прорастанию в течение нескольких часов, у других сохраняет жизнеспособность на протяжении нескольких суток. Так, у представителей семейства злаковых (кукуруза, пшеница, рожь) при благоприятных условиях хранения пыльца сохраняет жизнеспособность от 3 до 5 и более суток, у розоцветных – от 25 до 30, у лилейных – от 60 до 70 суток [3].

1.3 Фертильность пыльцы и методы определения ее жизнеспособности

1.3.1 Фертильность пыльцы

Принято различать термины жизнеспособность и оплодотворяющая способность  пыльцы. Полинологи отмечают, что жизнеспособность пыльцы можно определить как способность мужского гаметофита к росту на соответствующих тканях пестика, а оплодотворяющую способность, или зиготический потенциал, пыльцевого зерна как способность вызывать полное оплодотворение. Оплодотвояющую способность пыльцы еще называют фертильностью. Наиболее надежное определение жизнеспособности и фертильности дают методы in vivo. Для сравнительных оценок можно применять методы, которые основаны на реакциях окрашивания. Для определения фертильности пыльцы используют два метода: ацетокарминовый и йодный [18].

Ацетокарминовый метод. Фиксируют  пыльники со зрелой пыльцой в фиксаторе  Карнуа. Продолжительность фиксации колеблется от 30 минут до нескольких часов. Материал промывают и хранят в 80%-ном спирте. Из спирта пыльник переносят на предметное стекло и раздавливают в капле ацетокармина. Убрав лишние ткани, препарат накрывают покровным стеклом и осторожно подогревают на спиртовке. У фертильных пыльцевых зерен зернистая цитоплазма и спермин окрашены в густой карминово-красный цвет. Стерильные пыльцевые зерна почти не окрашиваются кармином или окрашиваются неравномерно. Их содержимое часто отходит от оболочки и находится на разных этапах гибели. Спермиев в таких пыльцевых зернах нет.

Указанные различия между фертильными  и стерильными пыльцевыми зернами  нетрудно установить, если пыльца имеет  тонкую экзину. Толстая экзина маскирует  содержимое пыльцы.

У многих культурных видов растений спермин образуются не в пыльце, а в пыльцевых трубках во время их прорастания в столбике. В таких случаях о фертильности пыльцевых зерен приходится судить относительно – по окрашиванию их содержимого.

При проведении пыльцевого анализа  на фертильность необходимо учитывать, что пыльцевые зерна в одном  соцветии могут быть на разных этапах развития. Так, в колосе пшеницы в одних цветках пыльцевые зерна несут спермин, а в других – недозрелые пыльцевые зерна с одним-двумя ядрами. Еще более усложняется картина при изучении отдаленных гибридов [4].

Кихара [19], работая с гибридом Triticum aestivum L. Ч Aegilops caudata L., выявил 5 типов пыльцевых зерен: 1) нормальные с одним вегетативным ядром и двумя эллиптическими ядрами спермиев; 2) почти нормальные с одним вегетативным и двумя округлыми ядрами спермиев; 3) двухъядерные; 4) одноядерные; 5) абортивные (стерильные). Из этих пяти типов только первый обладал способностью к функционированию.

Йодный метод. У некоторых культур, например у гречихи, пыльцевые зерна  имеют толстую экзину, через которую  трудно увидеть спермин при помощи ацетокарминовой методики. Удобным оказался йодный метод определения фертильности пыльцы. В основе этого метода лежит определение крахмала при помощи йодной реакции. Фертильные и стерильные пыльцевые зерна отличаются по содержанию крахмала; обычно фертильное пыльцевое зерно гречихи полностью заполнено крахмалом, а стерильное не имеет его совсем или содержит следы.

Приготовление реактива. Йодный раствор  готовят по рецепту Грама: 2 г йодистого  калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды при нагревании, затем в раствор добавляют 1 г металлического йода. Раствор, доведенный до 300 мл, хранят в склянке из оранжевого стекла.

Зрелые пыльники вскрывают двумя  иглами на предметном стекле, смачивают  йодным раствором и, удалив лишние ткани, накрывают покровным стеклом. Под микроскопом можно легко отличить фертильные пыльцевые зерна по темно-фиолетовому (почти черному) цвету. Стерильные пыльцевые зерна остаются неокрашенными, так как не содержат крахмала или имеют следы его. Неокрашенными оказываются и оболочки пыльцевых зерен.

У злаков можно рассматривать весь пыльник целиком (так как пыльца расположена в один слой), чтобы  не допустить ошибок в определении  стерильных пыльцевых зерен, за которые  по неопытности можно принять  оболочки разрушенных пыльцевых зерен.

Исследования Л.И. Орёл [20] по кукурузе показали, что по содержанию крахмала пыльцевые зерна делятся на группы. Так, было установлено, что содержание крахмала связано со степенью развития мужского гаметофита. Если формирование спермиев закончено, это соответствует норме по содержанию крахмала. Пыльцевые зерна с незавершенным развитием имеют крахмала меньше нормы. Двуклеточная пыльца содержит следы крахмала, а в одноядерной пыльце или следы крахмала, или его нет совсем. Синтез крахмала в стерильной пыльце не достигает нормы. Обнаружено также, что пыльцевые зерна, несущие спермин, не всегда фертильны, даже если в них содержится крахмал.