Применение иммуногистохимических методов в медицине

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ  ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

на тему: Применение иммуногистохимических методов в медицине

 

 

 

 

Выполнил: студентка 2 курса

лечебного факультета

Шамиданова К.В.

           Проверил: проф.Шевлюк Н.Н.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Оренбург,  2017

 

Содержание

 

Введение ………………………………………………… ………………. …….…..3

Глава 1. История развития метода….……………………………………………….3

Глава 2. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии ….....…...5

Глава 3.Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции..7

Глава 4. Проведение иммуногистохимической реакции ………….…………….11

Глава 5. Иммуногистохимия ангиогенеза……………………………………….15

Заключение …………………………………………………………………………18

Литература………………………………………………..……  ……..……………20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Иммуногистохимия (ИГХ) - метод выявления точной локализации клеточного или тканевого компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток.

В диагностической практике можно выделить несколько основных областей применения ИГХ: во-первых, при исследовании опухолей человека с целью определения гистогенеза недифференцированных опухолевых образований, отдаленных метастазов, для дифференцировки различных тканевых компонентов, составляющих комплексные опухоли; во-вторых, с целью прогностической оценки дальнейшего течения заболевания и, наконец, при назначении терапии.

Особую ценность иммуногистохимия приобретает в том случае, когда имеются трудности в определении гистогенетической принадлежности опухолевой ткани на основании изучения рутинных срезов, окрашенных гематоксилин-зозином, при этом морфологи нередко используют термин «недифференцированные опухоли». Выявление гистогенеза опухоли необходимо для решения вопроса о тактике лечения заболевания и прогностической оценке. Наибольшее клиническое применение в настоящее время ИГХ получила при классификации лейкозов и лимфом. Определенные панели антител позволяют охарактеризовать острые и хронические лейкозы, лимфогранулематоз и различные типы неходжкинских лимфом. Так, используя антитела к общему лейкоцитарному антигену, выявляют лимфомы, а антитела к белкам S-100 и HMB-45 позволяют определить меланомы.

 

Глава 1. История развития метода

 

Основной принцип иммуногистохимии был предложен 70 лет назад J.R. Marrack (1934) и заключается в том, что в качестве гистохимических реагентов используют антитела, к которым присоединяют определенный флуоресцентный маркер. Авторами метода по праву считается группа исследователей под руководством A.H. Coons, которая в 1942 году впервые с помощью антител, меченных изоцианатом, выявила антигены пневмококков в инфицированных тканях (Coons A.H. et al., 1941; 1955). Затем ИГХ применяли в области эндокринологии для выявления мест синтеза различных гормонов. Однако эта методика не находила широкого применения из-за сложностей, связанных с использованием флуоресцентных микроскопов, трудностей выявления основных компонентов тканей и высокой чувствительности флуоресцентных маркеров к дегидратации.

Одним из важных открытий для дальнейшего широкого использования иммуногистохимии было выявление в 1951 году J.M. Marshall возможности локализовать in vitro молекулы адренокортикотропного гормона в гипофизе с помощью антител, меченных флуоресцентными маркерами. Локализация эндогенных антигенов in vivo была осуществлена через 4 года с помощью непрямого метода. В этих экспериментах кроличья антисыворотка против крысиного почечного антигена была введена крысам и на замороженных срезах почки крысы было выявлено наличие гамма-глобулинов с помощью меченных флуоресцентным маркером цыплячьих антител против кроличьих глобулинов.

В 1960 году для осуществления визуализации антител в электронной микроскопии было введено большое количество маркеров тяжелых металлов, таких как ферритин, коллоидное золото. Тяжелые металлы не являются идеальными маркерами для иммуногистохимии по самым различным техническим причинам, хотя сейчас применяются оригинальные методики с использованием коллоидного золота.

Методы использования конъюгированных ферментами антител были независимо разработаны P.K. Nakane, G.B. Pierce (1966) и S. Avrameas, J. Uriel (1966). Наибольшую популярность получил пероксидазно-антипероксидазный метод L.A. Sternberger с соавт. (1977). Для визуализации энзиматических маркеров в конце реакции антиген-антитело проводят гистохимическую реакцию, в результате которой фермент становится видимым на световом уровне. Дальнейшее усовершенствование этой реакции привело к тому, что продукты реакции были видны и на электронно-микроскопическом уровне, за счет взаимодействия с осмием они становились электронно-плотными.

В последние годы применение иммуногистохимии в морфологии широко развивалось в связи с разработкой новых методов конъюгации антител, фиксации тканей, демаскирования антигенов, а также использования новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии.

 

Глава 2. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии

 

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген-антитело».

Антигены - чужеродные вещества сложной органической природы, способные при попадании в организм вызывать иммунные реакции. Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом.

Различают полные и неполные антигены. Полные антигены - это белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, синтетические высокополимерные соединения, вирусы, паразиты, бактерии. Неполные антигены, или гаптены, - низкомолекулярные соединения, которые сами по себе не могут вызывать иммунного ответа, однако, соединяясь с клетками и тканями организма, в комплексе становятся полными антигенами, способными вызывать иммунный ответ.

Антитела - вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатывались.

Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов - близкие по химическому строению и свойствам глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, способствуют образованию антител. У человека и высших позвоночных известно 5 классов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Молекулы иммуноглобулинов (Ig) построены из легких и тяжелых полипептидных цепей, расположенных симметрично (L- и H-цепи). Легкие и тяжелые цепи состоят из двух областей – вариабельной и постоянной. Вариабельные участки принимают участие в контакте с антигеном, это определяет специфичность антител. Антитела чувствительны к протеолитическим ферментам и распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагменты сохраняют свою способность связываться с антигеном. Fc-фрагмент не способен связываться с антигеном, он определяет специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента; именно к этой части антитела можно присоединить различные вещества; в частности для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту присоединяют биотин, флуорохромы или ферменты.

Структурное разнообразие антител определяется последовательностью аминокислот в вариабельных областях тяжелых и легких цепей. Постоянные области иммуноглобулинов кодируются одним геном для каждого класса антител. И антитела, и антигены могут быть поливалентными (т.е. иметь множество участков связывания) в результате повторения эпитопов и в результате наличия многих эпитопов, с которыми будут связываться разные антитела.

Антитела, которые используются в иммунологических методиках, получают путем повторной иммунизации различных животных (чаще мышей, кроликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных протеинов.

Поскольку большие молекулы могут иметь несколько эпитопов, они стимулируют множество линий В-клеток, которые синтезируют несколько видов антител к разным эпитопам одного и того же антигена. Получаемые антитела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным эпитопам антигена.

Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточного клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммунологически идентичными и реагируют с одним эпитопом антигена, к которому они были получены. Получение моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка В-лимфоцитов селезенки к слиянию; слияние с клетками миеломы; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител.

Важнейшим этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген - антитело». Антитела обладают свойством прочно связываться с тканевыми антигенами, при этом не связанные антитела можно удалить отмыванием срезов. Поскольку окрашенные продукты реакции являются нерастворимыми, они оседают в месте взаимодействия антител. Для выявления образовавшегося в процессе реакции комплекса «антиген - антитело», используют различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител: ферменты, флуорохромы, биотин, металлы.

В настоящее время в качестве окрашенных меток широко используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Окисление пероксидазы хрена с помощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции коричневую окраску, в то время как щелочная фосфатаза после взаимодействия с различными субстратами (AS-MX фосфат, 5-бром-4-хлоро-3-индоксил фосфат и др.) формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от используемого красителя можно окрасить в синий (прочный синий ВВ) или красный (прочный красный TR) цвет.

Подобным образом осуществляется визуализация первоначально не видимых тканевых и клеточных антигенов с помощью иммуногистохимической методики.

 

Глава 3. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции

 

Подготовка клеток и тканей. Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла. Затем срезы освобождаются от парафина, на них проводят демаскирование антигенов, блокируют неспецифическое связывание белков и эндогенную пероксидазную активность и затем проводят инкубацию с первичными антителами. Связавшиеся первичные антитела выявляют, добавляя вторичные антитела, конъюгированные при помощи полимера с пероксидазой хрена, и осуществляют визуализацию вторичных антител при помощи субстрата - диаминобензидина. После достижения максимальной интенсивности окрашивания, срезы промывают водой для прекращения реакции, докрашивают гематоксилином и заключают в заливочную среду.

Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань. Выбор исследуемого материала должен определяться свойствами изучаемого антигена: так, большинство цитоплазматических антигенов выявляются на фиксированных формальдегидом и залитых в парафин срезах; поверхностные клеточные антигены, как правило, разрушаются или маскируются при обычной фиксации и могут быть выявлены только на свежезамороженных тканях либо в культуре клеток.

Фиксация. Основная часть гистологических и цитологических методик направлена на сохранение морфологической структуры клеток и тканей, для этого исследуемые образцы помещают в фиксирующие растворы. Фиксация необходима для предотвращения аутолиза антигенов; при этом блокируются лизосомные ферменты и предотвращается рост бактерий, которые вызывают разрушение клеточной структуры.

Положительный результат иммуногистохимической реакции во многом определяется адекватной фиксацией исследуемых антигенов в тканях. Выявляемый антиген должен быть нерастворимым в жидкостях за счет процесса фиксации его к тканевым компонентам. Особенностью антигена является доступность его первичной структуры для антител. С другой стороны, за счет денатурации белков, фиксация вызывает структурные изменения и инактивацию антигенного профиля клеток. Идеальный фиксатор должен сохранять морфологию исследуемого материала, закреплять исследуемый антиген в месте его распределения и не нарушать его антигенные свойства. До настоящего времени подобного фиксатора не описано.

Выбор специфического фиксатора для отдельных компонентов клетки имеет большое значение. Из этих компонентов важную роль играют белки клетки, а лучшим для них фиксатором является формалин; в тех случаях, когда формалин использовать нельзя, его обычно заменяют спиртом или ацетоном. В частности, антигены промежуточных филаментов лучше выявлять на свежезамороженных срезах или тканях, фиксированных в спиртах.

Фиксация мазков крови и цитологических препаратов. Перед фиксацией препараты высушивают 1-2 часа при комнатной температуре для предотвращения повреждения клеток. При высушивании клетки плотно прилипают к стеклу и не смываются при последующей фиксации. Высушивание не повреждает структуры поверхностных антигенов лейкоцитов. Мазки фиксируют либо в абсолютном ацетоне, либо в 96° этаноле 1-3 мин, с последующей окраской клеток.

Приготовление срезов тканей. Иммуногистохимия на криостатных срезах. Криостатные срезы подходят для выявления большинства антигенов. Срезы толщиной 5 мкм помещают на покрытые поли-L-лизином стекла и высушивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Срезы фиксируют, погружая в холодный ацетон -20 °С, либо другой фиксатор (этиловый спирт, формалин и т.п.) на 2 мин. Стекла высушивают на воздухе и проводят регидратацию в 1% неиммунной бычьей сыворотке в солевом фосфатном буфере (PBS), затем осуществляют иммуногистохимическую реакцию.