Применение иммуногистохимических методов в медицине

Иммуногистохимия на парафиновых срезах. Современные методы демаскирования клеточных антигенов позволяют проводить ИГХ реакции на парафиновых срезах. При этом в качестве фиксатора может быть использован 10% раствор забуференного формальдегида.

Заливка в парафин:

1. Фиксация в забуференном формалине - сутки.
2. Промывка в проточной воде - 2 часа.
3. 70% этанол - 30 мин.
4. 80% этанол - 30 мин.
5. 90% этанол - 30 мин.
6. 100% этанол - 3 смены по 1 часу.
7. Ксилол/ этанол 1:1 - 15 мин.
8. Ксилол - 2 смены по 30 мин.
9. Ксилол/ парафин 1:1 при 56?С - 30 мин.
10. Парафин - 2 смены при 56?С 1 час.
11. Заливка.

Перед проведением ИГХ реакции на парафиновых срезах необходимо осуществить их регидратацию. Срезы толщиной 4-5 мкм режутся на покрытые поли-L-лизином стекла, затем высушиваются при 37?С в течение ночи и 1 час при 60 °С.

Регидратация:

1. Ксилол - 3 смены по 5 мин.
2. 100% этанол - 2 смены по 3 мин.
3. 96% этанол - 2 смены по 3 мин.
4. 80% этанол - 3 мин.
5. Дистиллированная вода - 2 смены по 3 мин.

Демаскирование антигенов. После фиксации в формалине и заливки в парафин тканевые антигены необходимо демаскировать. Эта процедура направлена на восстановление оригинальной структуры белка. Методы демаскирования антигенов, такие как обработка протеолитическими ферментами или нагревание в микроволновой печи после формалиновой фиксации и заключения в парафин способствуют обнаружению не выявляемых ранее антигенов.

Демаскирование клеточных антигенов ферментами (трипсин, протеиназа К, проназа) применяется, как правило, для цитокератинов и некоторых других клеточных антигенов. Другой способ «освобождения» антигенов осуществляется путем нагревания, при этом отмечается усиление иммуногистохимической реакции на срезах, фиксированных в формалине. Для нагревания можно использовать как водяную баню, так и микроволновую печь. Как правило, нагревание срезов проводят в 10 мМ цитратном буфере при рН 6,0.

Протокол обработки срезов ферментами:

1. Поместить срезы в дистиллированную воду.
2. Приготовить 0,1% раствор трипсина или протеиназы К в PBS (рН 7,6).
3. Инкубировать при 37 °С от 15 до 60 мин.
4. Остановить действие фермента ополаскиванием в холодной воде.
5. Перенести в PBS.

Протокол обработки срезов в микроволновой печи:

1. Поместить срезы в пластиковый контейнер с 10 мМ цитратным буфером (pH 6,0).
2. Нагревать срезы при мощности 700 Вт 7 мин.
3. Долить испарившуюся жидкость и нагревать срезы при мощности 350 Вт 20 мин.
4. Остудить срезы вне печи в течение 15 мин.
5. Перенести срезы в PBS.

Блокировка эндогенной активности ферментов

Эндогенная активность пероксидазы. Пероксидазная активность встречается во многих клетках организма: эритроцитах (гемоглобин), миоцитах (миоглобин), макрофагах и нейтрофилах (цитохромы), гепатоцитах и эпителии почек (каталаза). Для нейтрализации эндогенной пероксидазной активности на срезы на 10 мин наносят 1-3% раствор перекиси водорода.

Эндогенная активность щелочной фосфатазы. Блокирование щелочной фосфатазы осуществляют 5 мМ раствором левамизоля.

Биотин. Витамин Н - биотин - присутствует в печени, почках и др. органах. При использовании по время ИГХ реакции пероксидазно-авидинового комплекса для визуализации меченых биотином вторичных антител, возможно его неспецифическое связывание с клеточными компонентами, содержащими эндогенный биотин. Для предотвращения подобной неспецифической реакции перед осуществлением блокирования эндогенной пероксидазы проводят инкубацию срезов в 0,1% р-ре авидина, а затем в 0,01% растворе биотина в Трис-буфере (ТБС). Второй способ избежать неспецифической реакции с биотином - это использование современных безбиотиновых систем визуализации антигенов.

Глава 4. Проведение иммуногистохимической реакции

Существует множество различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена: прямой метод, непрямые методы, методы с использованием ферментных иммунных комплексов, авидин-биотиновые методы и др.

Прямой метод. Эта методика была разработана A.H. Coons, M.H. Kaplan (1950). Меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом) первичные антитела наносили непосредственно на срезы. После инкубации несвязанные антитела смывали фосфатным буфером и с помощью ультрафиолетового света выявляли места локализации антигенов по зеленоватой флюоресценции.

Непрямой метод. Был также описан A.H. Coons с соавт. (1955). Этот метод более чувствителен, чем прямой, т.е. то же количество первичных антител, присоединенных к тканевым антигенам, будет более интенсивно окрашиваться по сравнению с прямым методом либо то же количество антигенов можно локализовать за счет более низкой концентрации первичных антител. Первичные немеченые антитела наносят на срезы, а их избыток смывается буфером. Затем наносятся вторичные конъюгированные с ФИТЦ антитела, принадлежащие другому виду животных, полученные к гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови животных, использовавшихся в качестве первичных антител. В этом случае первичные антитела, связавшиеся с антигенами исследуемой ткани являются антигенами для меченых вторичных антител, которые также распределяются в месте локализации тканевых антигенов. Другим преимуществом непрямого метода является возможность применения одних и тех же меченых вторичных антител, при использовании первичных антител от одного и того же вида животных. Маркеры для этого метода могут быть флуоресцентными (флуоресцин, родамин), ферментными (пероксидаза хрена), а также коллоидное золото.

Не конъюгированный антигенно-ферментный метод. Название связано с тем, что как первичные, так и вторичные антитела не конъюгируются с маркерами. В свою очередь, вторичные антитела используются как мостик между первичными антителами и конечными, которые также не конъюгируются, а получаются путем иммунизации животных того же вида, что и первичные антитела к пероксидазе хрена. За последним слоем антител наносится пероксидаза хрена, которая присоединяется путем реакции антиген-антитело и затем проявляется гистохимически. За счет отсутствия химической конъюгации, не повреждается иммунологическая реактивность всех антител.

Одиночный мост. Первым слоем может быть кроличья сыворотка, полученная против первичного антигена, второй слой - неконъюгированная сыворотка козы против кроличьих гаммаглобулинов и третий слой - кроличья сыворотка, полученная против пероксидазы хрена, которая затем проявляется гистохимическим методом, таким как диаминобензидин и перекись водорода по R.C. Graham и M.J. Karnovsky (1966).

Двойной мост. Он включает повторение второго слоя, сыворотки козы против кроличьих иммуноглобулинов после кроличьей антипероксидазной сыворотки и затем повторение кроличьей антипероксидазной сыворотки перед нанесением пероксидазы и её визуализацией, таким образом достигается увеличение числа мест, связывающих пероксидазу.

Пероксидазно-антипероксидазный метод. Развитие этого метода L.A. Sternberger (1979) оказало большое влияние на иммуногистохимию. Модификация Штейнбергом мостовой методики заключалась в проведении реакции антипероксидазных антител с пероксидазой перед нанесением их на ткани. Эта реакция приводила к образованию стабильного комплекса трех молекул пероксидазы хрена с двумя молекулами антител. Этот комплекс отделялся от непрореагировавших антител и пероксидазы перед использованием. Он реагирует как антиген третьего слоя. Первый слой составляют кроличьи антитела, реагирующие с тканевыми антигенами, второй слой образует неконъюгированная вторичная сыворотка козы против кроличьих антител в избытке, таким образом одно из парных соединительных мест антител (Fab-часть) является свободной для реагирования с третьим слоем кроличьего ПАП комплекса. Таким образом, обеспечивается высокое соотношение между количеством пероксидазного маркера и первичным антигеном. Кроличьи ПАП молекулы реагируют только с антикроличьими иммуноглобулинами козы второго слоя, и это обеспечивает отсутствие неспецифического связывания с тканью. Это специфичная и свободная от фона реакция. Для увеличения интенсивности, нанесение второго и третьего слоев можно повторить.

Авидин-биотиновый метод. Два новых вещества стали использовались в иммуногистохимии после исследований J.L. Guesdon с соавт. (1979) - биотин и авидин. Биотин (витамин Н) в большом количестве содержится в белках птичьих яиц, где он связан с большим гликопротеидом - авидином. Авидин имеет высокую аффинность к биотину, одна его молекула может присоединить 4 молекулы биотина. Биотин может связываться с Fc-иммуноглобулинами, каждая молекула биотина имеет одно место связывания, но с одной молекулой иммуноглобулина могут связываться несколько молекул биотина. Как биотин, так и авидин могут быть помечены флуоресцентной меткой, ферментом, ферритином или молекулой золота. Методика с использованием авидин-биотиновых комплексов считается соответствующей либо даже превышающей ПАП метод по чувствительности. В этой методике первый слой представляют первичные кроличьи антитела; второй слой составляют биотинилированные антикроличьи иммуноглобулины козы; третий слой представлен авидин-биотиновым комплексом. Авидин реагирует с биотинилированной пероксидазой хрена в такой пропорции, при которой три связывающих места авидина взаимодействуют с биотинилированной пероксидазой, оставшееся одно место на каждой молекуле является свободным для взаимодействия с биотином второго слоя антител. Метод блокирования неспецифического взаимодействия с тканевым биотином был предложен G.S. Wood и R. Warnke (1981). Неконъюгированный авидин наносится на ткани для связывания биотина и затем добавляется в избытке неконъюгированный биотин для предупреждения любого связывания авидин-биотинового комплекса.

В последнее время различными фирмами разработаны новые методы визуализации иммуногистохимической реакции с использованием конъюгатов полимеров. К длинной молекуле полимера присоединяется большое количество фермента. За счет увеличения концентрации фермента повышается чувствительность метода. При этом с полимером могут быть конъюгированы как первичные антитела, так и молекулы фермента EPOS (Enhanced Polymer One Stepstaining) фирмы Dako. Если с молекулой полимера конъюгируются вторичные антитела и фермент (EnVision, фирмы Dako), то иммуногистохимическая реакция проводится в два этапа, при этом достигается высокая чувствительность по сравнению с другими методами визуализации.

Наибольшую популярность в настоящее время получили иммуногистохимические методики, использующие для визуализации реакции ферменты пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, с использованием стрептовидинбиотинового комплекса. Эта методика проводится в три этапа: нанесение неокрашенных первичных антител, затем биотинилированных вторичных антител и добавление связанного с молекулами фермента стрептовидина (Dabbs D.J., 2002). Необходимо отметить, что чувствительность ИГХ методики во многом зависит от используемых реагентов и особенностей проведения реакции, в связи с чем, сложно сравнивать результаты ИГХ при использовании различных реактивов и методических приемов.

Важными условиями проведения иммуногистохимической реакции является подбор титра антител. Титром антител называют максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдается выраженное специфическое окрашивание без неспецифического фонового окрашивания окружающих тканей. Все коммерческие антитела имеют инструкции с описанием оптимального разведения, однако часто подбирать титр антител приходится экспериментально, поскольку этот показатель зависит от таких причин, как длительность инкубации первичной сыворотки, окружающая температура, выбранная система визуализации распределения первичных антител и т.п.

Перед нанесением первичных антител срезы помещают на 1-2 мин в PBS, затем необходимо удалить избыток буфера вокруг среза и капнуть на срез небольшое количество первичной сыворотки от 30 до 50 мкл в зависимости от площади среза. Затем срезы помещают горизонтально во влажную герметичную камеру на подставку, под которой находится фильтровальная бумага, смоченная водой, для предотвращения неспецифического связывания антител с тканью за счет их высыхания. И проводят инкубацию при комнатной температуре в течение 15-30 мин в зависимости от рекомендаций производителя антител. Для ускорения процессов связывания антител с антигенами можно проводить инкубацию при температуре 37?С. Для повышения интенсивности ИГХ реакции и увеличения разведения используемой сыворотки можно проводить реакцию при 4 °С в холодильнике в течение ночи.

Глава 5. Иммуногистохимия ангиогенеза

Формирование кровеносных сосудов и/или кровеносной системы определяется двумя процессами: васкулогенезом и ангиогенезом.

Васкулогенез заключается в дифференцировке ангиобластов (предшественников эндотелиальных клеток) у эмбрионов в кровяных островках, которые после слияния формируют сердечно-сосудистую систему или васкуляризируют эндодермальные органы.

Ангиогенез включает в себя пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток в первичных васкулярных структурах и способствует васкуляризации эктодермальных и мезенхимных органов, реконструкции капиллярной сети.

Ангиогенез необходим для процессов заживления ран, развития многих эмбриональных тканей и плаценты, а также для циклических репродуктивных изменений в женском организме, связанных с формированием желтого тела, ростом эндометрия и лактацией.

Факторы, стимулирующие образование кровеносных сосудов, носят название ангиогенных. К ним относятся: фактор роста сосудов эндотелия (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), ангиогенин, трансформирующий фактор роста-α (TGF-α). Все ангиогенные факторы можно подразделить на 2 группы: первая непосредственно влияет на эндотелиальные клетки, вторая является группой факторов, осуществляющих свое действие опосредованно через макрофаги, которые выделяют факторы роста и цитокины. К факторам второй группы принадлежит ангиогенин.

В новообразованиях процессы неоваскуляризации составляют важный компонент инвазивной и метастатической активности. Данные, накопленные за последнее десятилетие, убедительно показывают необходимость ангиогенеза для роста подавляющего большинства злокачественных опухолей. Формирование сети капилляров из эндотелиальных клеток, выстилающих мелкие венулы, - необходимое условие для дальнейшего роста опухолевого узелка, достигшего в диаметре 2-4 мм. Процессы образования и роста кровеносных сосудов необходимы и для развития метастазов.

Капиллярная сеть сначала развивается в прилежащих к опухоли тканях, которые впоследствии замещаются неопластическими клетками. При этом, хотя капиллярная сеть, окружающая опухоль, формируется из клеток нормального эндотелия организма, однако заметно отличается от нормальной по морфологии, плотности и проницаемости сосудов. Плотная сеть капилляров снабжает развивающуюся опухоль кислородом, необходимыми питательными веществами и позволяет выводить токсичные продукты жизнедеятельности опухолевых клеток. Наличие капиллярной сети облегчает также внедрение и распространение клеток метастазирующих опухолей. Таким образом, для того чтобы злокачественное новообразование превысило в толщину несколько слоев живых клеток, необходима высокоспециализированная система капилляров.