Шпаргалка по "Микробиологии"

ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ

Краски, применяемые в  микробиологической практике. Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов  готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий;

 Красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

Фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет;

Зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый;

Желто-коричневые - хризоилин, везувин.

При простом методе окраски на фиксированный  мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного  раствора красок на 1—2 минуты; чаще всего  для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая  синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между  двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10—30 секунд, а метиленовой синькой  – 2-10 мин. Фуксин окрашивает мазки более  интенсивно. А при окраске метиленовой  синькой получаются нежные, более  изящные препараты. Мазок после  обсушивания фильтровальной бумагой  должен быть совершенно сухим, в противном  случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится  неясное изображение. Вообще же продолжительность  окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости  микроба к окраске и толщины  мазка.

При простой окраске микробные  тела воспринимают цвет применяемой  краски так же интенсивно, как и  ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок  из чистой культуры) окрашиваются в  тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся  к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок. Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.

 

 

4. систематика и номенклатура микроорганизмов. Современная классификация микроорганизмов.

Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид.Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками.

Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками:

1) серовары (по антигенной структуре);

2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам);

3) фаговары (по чувствительности к фагам);

4) ферментовары;

5) бактериоциновары;

6) бактериоциногеновары.

Бактериоцины – вещества, продуцируемые  бактериями и губительно действующие  на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактерициногеновары.

Свойства бактерий:

1) морфологические;

2) тинкториальные;

3) культуральные;

4) биохимические;

5) антигенные.

Виды объединяют в роды, роды –  в семейства, семейства – в  порядки. Более высокими таксономическими категориями являются классы, отделы, подцарства и царства.

Патогенные микроорганизмы относятся  к царству прокариот, патогенные простейшие и грибы – к царству  эукариот, вирусы объединяются в отдельное  царство – Vira.

Все прокариоты, имеющие единый тип  организации клеток, объединены в  один отдел – Bacteria, в котором выделяют:

1) собственно бактерии;

2) актиномицеты;

3) спирохеты;

4) риккетсии;

5) хламидии;

6) микоплазмы.

Для систематики микроорганизмов  используются:

1) нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков;

2) серотаксономия. Изучает антигены бактерий с помощью реакций с иммунными сыворотками;

3) хемотакcономия. Применяются физико-химические методы, с помощью которых исследуется липидный, аминокислотный состав микробной клетки и определенных ее компонентов;

4) генная систематика. Основана на способности бактерий с гомологичными ДНК к трансформации, трансдукции и конъюгации, на анализе внехромосомных факторов наследственности – плазмид, транспозонов, фагов.

Чистая культура – это бактерии одного вида, выращенные на питательной  среде.

5. строение светового микроскопа. Особенности микроскопии под иммерсионной системой.

Устройство светового  микроскопа и работа с ним. 

Микроскоп - сложный оптический прибор, используемый для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов. Принципиально все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы.

Механическую часть составляют: основание микроскопа, тубусодержатель, тубус, система винтов для передвижения, предметный столик и револьвер. Оптическую часть составляют - окуляр, объективы  и осветительный аппарат.

Работа с иммерсионной системой. Объективы малого увеличения (´3,5, ´8, ´9) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (´20, ´40) - для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n=1) и стекла (n=1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив. Объективы больших увеличений (´85, ´90) носят название иммерсионных. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла.

Вначале под малым увеличением  микроскопа  наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят  каплю иммерсии и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (´90). Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют точную фокусировку. По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком фильтровальной бумаги убирают иммерсию.

6. морфология и строение микробной клетки. Отличие строения прокариотической и эукариотической клетки.

Морфология бактерий. По форме бактерий подразделяют на три основные группы: шаровидные (кокки), цилиндрические (палочки) и извитые (рис. 3).

 Для различных видов кокков характерно своеобразное расположение клеток, обусловленное способом деления.

Микрококки - беспорядочно расположенные кокки, в диаметре не превышают 0,5 мкм. 

Диплококки - кокки, располагающиеся попарно, делятся в одной плоскости.

 Стрептококки - деление их происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются, располагаясь цепочками, различной длины.

Тетракокки - сочетание шаровидных микробов по четыре, деление у которых происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях.

Стафилококки - делятся в различных плоскостях без особой закономерности, образуя беспорядочное скопление клеток, иногда напоминающее грозди винограда.

Сарцины по форме напоминают пакеты или тюки. Образуются в результате деления в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях.\

Палочковидные микроорганизмы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии.

Бактерии -цилиндрической формы, не образуют спор.

Бациллы - спорообразующие палочки по типу дыхания аэробы, т.е. для своего развития нуждаются в свободном молекулярном кислороде воздуха.

 Клостридии - спорообразующие палочки, по типу дыхания анаэробы (не использующие кислород воздуха), диаметр их споры превышает ширину микробной клетки.

Извитые бактерии разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты.

Вибрионы имеют форму запятой, летящей чайки, поворот вокруг оси не превышает четверти оборота.

Спириллы - характеризуются небольшим числом крупных завитков (не более пяти). Передвигаются с помощью жгутиков.

Спирохеты - имеют штопорообразную форму с большим количеством завитков. На конце тела пучком расположены жгутики.

Обязательными органоидами являются: ядерный аппарат, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана.

Необязательными (второстепенными) структурными элементами являются: клеточная стенка, капсула, споры, пили, жгутики.

1. В центре бактериальной клетки  находится нуклеоид - ядерное образование,  представленное чаще всего одной  хромосомой кольцевидной формы.  Состоит из двухцепочечной нити  ДНК. Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной.

2. Цитоплазма- сложная коллоидная система, содержащая различные включения метаболического происхождения (зерна волютина, гликогена, гранулезы и др.), рибосомы и другие элементы белоксинтезирующей системы, плазмиды (вненуклеоидное ДНК), мезосомы (образуются в результате инвагинации цитоплазматической мембраны в цитоплазму, участвуют в энергетическом обмене, спорообразовании, формировании межклеточной перегородки при делении).

3. Цитоплазматическая мембрана  ограничивает с наружной стороны  цитоплазму, имеет трехслойное строение  и выполняет ряд важнейших  функций- барьерную (создает и поддерживает осмотическое давление), энергетическую (содержит многие ферментные системы- дыхательные, окислительно- восстановительные, осуществляет перенос электронов), транспортную (перенос различных веществ в клетку и из клетки).

4. Клеточная стенка- присуща большинству бактерий (кроме микоплазм, ахолеплазм и некоторых других не имеющих истинной клеточной стенки микроорганизмов). Она обладает рядом функций, прежде всего обеспечивает механическую защиту и постоянную форму клеток, с ее наличием в значительной степени связаны антигенные свойства бактерий. В составе - два основных слоя, из которых наружный- более пластичный, внутренний- ригидный.

Основное химическое соединение клеточной  стенки, которое специфично только для бактерий- пептидогликан (муреиновые кислоты). От структуры и химического состава клеточной стенки бактерий зависит важный для систематики признак бактерий- отношение к окраске по Граму. В соответствии с ним выделяют две большие группы- грамположительные (“грам+”) и грамотрицательные (“грам - “) бактерии. Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода с генциановым фиолетовым (окрашены в сине- фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

Особенности клеточной стенки грамположительных  бактерий.

Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой  преобладают пептидогликан и  тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС), часто нет диаминопимелиновой кислоты.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных  бактерий.

Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно- имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная.

При обработке грамположительных  бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают полностью лишенные клеточной  стенки структуры- протопласты. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана, не разрушая полностью внешней мембраны; такие структуры называют сферопластами. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму (это свойство связано с осмотическим давлением и характерно для всех безклеточных форм бактерий).

L- формы бактерий.

Под действием ряда факторов, неблагоприятно действующих на бактериальную клетку (антибиотики, ферменты, антитела и  др.), происходит L- трансформация бактерий, приводящая к постоянной или временной утрате клеточной стенки. L- трансформация является не только формой изменчивости, но и приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования. В результате изменения антигенных свойств (утрата О- и К- антигенов), снижения вирулентности и других факторов L- формы приобретают способность длительно находиться (персистировать) в организме хозяина, поддерживая вяло текущий инфекционный процесс. Утрата клеточной стенки делает L- формы нечувствительными к антибиотикам, антителам и различным химиопрепаратам, точкой приложения которых является бактериальная клеточная стенка. Нестабильные L- формы способны реверсировать в классические (исходные) формы бактерий, имеющие клеточную стенку. Имеются также стабильные L- формы бактерий, отсутствие клеточной стенки и неспособность реверстровать которых в классические формы бактерий закреплены генетически. Они по ряду признаков очень напоминают микоплазмы и другие молликуты - бактерии, у которых клеточная стенка отсутствует как таксономический признак. Микроорганизмы, относящиеся к микоплазмам - самые мелкие прокариоты, не имеют клеточной стенки и как все бактериальные бесстеночные структуры имеют сферическую форму.