Питательные субстраты, применяемые в биотехнологии

Питательные субстраты, применяемые  в биотехнологии.

  Биосинтез пенициллинов методами ферментации в 1940-х годах ознаменовал собой начало эры промышленной биотехнологии. Общий объем биотехнологической продукции сегодня в мире измеряется в миллионах тонн в год. Любое производство начинается с сырья.

  Сырье в биотехнологических производствах, особенно крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расходов и составляет 40-65% общей стоимости продукции. При тонком биосинтезе доля сырья в общей себестоимости продукции уменьшается.

  Выбор между биосинтезом и химическим синтезом вещества определяется экономическими факторами. Вот почему такую важность имеет цена сырья.

  При химическом синтезе сырьем служит нефть или ее производные. При биосинтезе сырьем обычно являются крахмал, целлюлоза или побочные продукты пищевой промышленности (меласса, молочная сыворотка и пр.).

Эффективность процесса составляют следующие факторы:

1. количество субстрата, превращаемого в конечный продукт;
2. длительность синтеза;
3. стоимость отделения продукта от культуральной среды;

  4. стоимость уничтожения отходов или побочных продуктов производственного процесса или 
их возможное использование.

  Питательный субстрат, или питательная среда, является сложной трехфазной системой, содержащей жидкие, твердые и газообразные компоненты.

  Существует тесное взаимодействие между культивируемым объектом и физико-химическими факторами среды. В принципе, микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для промышленной биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ.

  Органическое сырье без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Тем не менее, целлюлозосодержащее сырье после химического или ферментативного гидролиза и очистки может быть использовано в биотехнологическом производстве.

  Из органического сырья наибольшее внимание биотехнологов привлекает крахмал, хотя для его ассимиляции микроорганизмами требуется сложный комплекс амилолитических ферментов, которыми владеют только некоторые виды микроорганизмов. Много крахмала расходуется для производства этанола, а также для приготовления фруктозных сиропов. Однако запасы крахмалсодержащего сырья ограниченны, поэтому используют мелассу, метанол, этанол и глюкозное сырье. При выборе сырья необходимо учитывать не только физиологические потребности выбранного продуцента, но и стоимость сырья.

  Углеродсодержащее сырье является основным сырьем микробного синтеза. К нему относятся парафиновые углеводороды нефти, метан как компонент природного газа, гидролизаты растительного сырья, этанол, уксусная кислота и т.д. Низкомолекулярные спирты (метанол и этанол) можно отнести к циклу перспективных видов микробиологического сырья, так как их ресурсы существенно увеличиваются благодаря успешному развитию технологии химического синтеза. Примером использования побочных продуктов является крахмальный экстракт, сульфитный щелок, зерновая и картофельная барда, меласса, молочная сыворотка и т.д.

Характеристика основных видов сырья.

  Распространенными источниками углерода и энергии являются компоненты нефти и природного газа. В состав сырой нефти входят парафиновые, нафтеновые и ароматические углеводороды с большей или меньшей примесью кислородсодержащих или сернистых соединений.

В зависимости от месторождения соотношение в нефти различных классов углеводородов варьирует.

  В наиболее распространенных сортах нефти содержится 50-60% нафтенов, 20-30% парафинов и 15-30% ароматических углеводородов. Каждый класс углеводородов представлен многочисленными гомологами и изомерами. Это обуславливает необходимость разделения нефти на фракции, что достигается путем ее перегонки или крекинга (превращения длинноцепочечных углеводородов в короткоцепочечные).

  Дизельная фракция (продукт переработки нефти) содержит не менее 15% парафинов и является источником парафиновых углеводородов, которые по структуре и молекулярной массе оптимальны для потребления бактериями и дрожжами

  Выделение парафинов из дизельной фракции осуществляют методами карбамидной депарафинизации или адсорбционного извлечения.

  Полученные жидкие парафины пригодны для культивирования микроорганизмов и имеют следующий состав (в %):

1. п-алканы (парафиновые углеводороды) с числом углеродных атомов от 10 до 20 - 98%
2. ароматические углеводороды - 0,2%
3. сера - 0,05%,

  Практически все сказанное о нефти относится и к природному газу - сложной смеси органических (углеводороды и их производные) и неорганических веществ. Концентрация метана в природном газе может приближаться к 100%.

  Вместе с тем круг метанотрофов - микроорганизмов, способных непосредственно утилизировать метан, сравнительно ограничен.

  Используемый природный газ требует перед подачей в ферментер дополнительной очистки от соединений, сильно ингибирующих рост клетки. Ограниченность ресурсов нефти и газа вынуждает биотехнологов изыскивать иные, в первую очередь возобновляемые источники сырья.

  В этой связи большое внимание уделяют различным видам растительной массы: плодам, сокам, клубням, травяной массе, древесине. Применяют отходы сельского хозяйства, деревообрабатывающей и бумажной промышленности, что позволяет реализовать с помощью биотехнологии принцип безотходного производства.

  Половину высушенной растительной биомассы составляет целлюлоза - самый распространенный биополимер. Как полисахарид целлюлоза представляет собой ценный источник углерода и энергии. Химический состав растительного сырья неодинаков.

  Главной частью растительного сырья являются полисахариды (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества) - 40-75% и лигнин- от 15 до 60%.

  Лигнин- нерастворимый при гидролизе остаток растительного сырья- находит ограниченное применение и является балластом.

  Основным способом гидролиза растительного сырья является перколяционный гидролиз серной кислотой при повышенных давлении и температуре.

  По этому способу горячая разбавленная кислота (жидкая фаза) непрерывно протекает через слой неподвижной твердой фазы (измельченное растительное сырье), которая полностью погружена в жидкость.

  В гидролизатах основной примесью, подавляющей обмен веществ, рост и развитие микроорганизмов, являются фурфурол (выше 0,02%) и оксиметилфурфурол (выше 0,1%).

  Для получения биологически доброкачественных гидролизатов осуществляют дальнейшую обработку, включающую в себя нейтрализацию кислот, отделение осадков и коллоидных частиц, охлаждение до 30°С, удаление вредных летучих примесей.

  Основными недостатками процесса гидролиза древесины являются образование крупнотоннажного отхода - лигнина и низкое качество гидролизата с точки зрения микробиологического синтеза.

  В настоящее время интенсивно разрабатываются более совершенные процессы гидролиза растительного сырья.

Перспективным направлением является ферментативный гидролиз целлюлозы.

Основным источником этанола является нефтехимический синтез.

Известны также промышленные способы получения других подобных продуктов.

  «Гидролизный спирт» получают путем сбраживания гексоз, содержащихся в гидролизатах растительного сырья.

  «Пищевой» этанол- образуется в процессе брожения моносахаридов при ферментативном гидролизе крахмала.

  Производство синтетического этилового спирта основано на сернокислотной гидратации этилена или прямой гидратации этилена водяным паром. Для получения товарного продукта этанол-сырец подается на ректификацию.

  Полученный этанол в виде азеотропа (96% этанола и 4% воды) с минимальным содержанием ингибирующих примесей (не более 0,005%) является готовым субстратом для культивирования микроорганизмов.

  В последние годы установлено, что уксусная кислота представляет собой очень перспективный субстрат для биотехнологии: на ней хорошо развиваются дрожжи как источник микробного белка, однако наиболее интересно применение уксусной кислоты в биосинтезе лизина.

  Ввиду необходимости использования в качестве субстрата большого количества уксусной кислоты целесообразно получение ее каким-либо крупнотоннажным способом, в частности химическим синтезом из этилена через ацетальдегид или карбонилированием метанола.

  Пищевая уксусная кислота издавна получается путем окисления этанола культурами бактерии рода Acetobacter.

  Меласса, содержит до 50% сахарозы, является отходом сахарного производства и очень широко используется в микробиологическом синтезе, так как многие продуценты белка и биологически активных веществ прекрасно утилизируют углеводы из мелассы.

Поступающая на свеклосахарный завод свекла проходит очистку, затем подается на свеклорезку, где изрезывается в стружку. Полученная свекловичная стружка подается в емкости для набухания и экстракции диффузионного сока. После фильтрации диффузионный сок подается на выпарную установку, где сгущается до содержания сухих веществ 60-65%. Дальнейшее сгущение сиропа до содержания сухих веществ 95-98% осуществляется в вакуум-аппарате (кристализация сахарозы). Вязкая жидкость - меласса в качестве отхода производства отправляется на склад 
 
 
 

Субстраты для культивирования микроорганизмов с целью получения белка

В качестве источников вещества и энергии микроорганизмы используют самые разнообразные  субстраты - нормальные парафины и дистилляты нефти, природный газ, спирты, растительные гидролизаты и отходы промышленных предприятий.

Для выращивания  микроорганизмов с целью получения  белка хорошо бы иметь богатый  углеродом, но дешевый субстрат. Этому  требованию вполне отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти. Выход  биомассы может достигать при  их использовании до 100% от массы субстрата. Качество продукта зависит от степени чистоты парафинов. При использовании парафинов достаточной степени очистки, полученная дрожжевая масса может успешно применяться в качестве дополнительного источника белка в рационах животных. Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70 000 т. в год. был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica. В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило 1 млн. т. в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира, вместе взятых.  Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них - необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.

В нашей стране мало районов, пригодных для выращивания  сои, являющейся основным источником белковых добавок. Поэтому налажено крупнотоннажное производство кормовых дрожжей на n-парафинах. Действует несколько заводов мощностью от 70 до 240 тыс. тонн в год. Сырьем служат жидкие очищенные парафины.

Одним из перспективных  источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества считается метиловый спирт. Его можно получать методом микробного синтеза на таких субстратах, как древесина, солома, городские отходы. Использование метанола в качестве субстрата затруднено из-за его химической структуры: молекула метанола содержит один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Наилучшими продуцентами на этом субстрате считаются бактерии, потому что они могут расти на метаноле с добавлением минеральных солей. Процессы получения белка на метаноле достаточно экономичны. По данным концерна Ай-Си-Ай (Великобритания), себестоимость продукта, производимого на метаноле, на 10-15% ниже, чем при аналогичном производстве, базирующемся на основе высокоочищенных n-парафинов. Высокобелковые продукты из метанола получают фирмы ряда развитых стран мира: Великобритании, Швеции, Германии, США, Италии. Продуцентами белка служат бактерии рода Methylomonas. Выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, выгодно, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. При росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот - дегидрогеназой. Ведутся генно-инженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.