Определение витамина В12 в биологических объектах

На развитие пропионовокислых бактерий и биосинтез витамина существенное влияние оказывают некоторые минеральные компоненты среды. Выше была отмечена необходимость введения солей кобальта. Цинк в виде сульфата (0,001%) тормозит развитие культуры более чем в 2 раза и почти в 4 раза снижает образование витамина. Токсическое действие цинка устраняют ион никеля или гипосульфит. Хром усиливает развитие бактерий, но тормозит синтез. Заметное снижение количества истинного витамина вызывает сульфат марганца. Способный легко окисляться ион марганца тормозит, вероятно, одну из стадий биосинтеза как восстановитель.

Витамин В12 выполняет определенные функции в обмене веществ продуцирующих его микроорганизмов. Он входит в виде коэнзима в состав ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов, т. е. в процессах, происходящих в организме в период интенсивного роста. В связи с этим становится понятным, почему при выращивании пропионовокислых бактерий образование и накопление витамина происходит параллельно накоплению бактериальной массы только в первые сутки развития культуры. Дальнейшее снижение продуктивности бактериальной массы в отношении витамина В12 свидетельствует о том, что потребность в витамине у культуры продуцента удовлетворяется накопленным количеством. Можно предполагать, что и в случае с Act. olivaceus сам организм-продуцент не нуждается в таком количестве витамина, какое он образует.

Получение витамина B12 путем термофильного метанового брожения отходов спиртовой промышленности. В последние годы, помимо перечисленных выше способов получения витамина В12 предложен метод, позволяющий использовать в качестве продуцентов термофильные метановые бактерии. Процесс брожения часто используют для обезвреживания сточных вод. При метановом брожении происходит восстановление СO2 или СО молекулярным водородом или водородом, отцепляющимся от органических веществ в процессе их дегидрирования. В специальных аппаратах, так называемых метантанках, гнилостными бактериями осуществляется протеолиз белков сточных вод до аминокислот с последующим их дезаминированием. Образовавшиеся в результате этих реакций жирные кислоты сбраживаются метановыми бактериями. Метановые бактерии, как известно, представляют собой смесь различных культур (до 70 штаммов) и образуют, как его иногда называют, активный ил. Оптимальными условиями для одновременного развития гнилостных и термофильных метановых бактерий является pH 7,0—7,5, температура — 52—53°.

Для получения витамина B12 при метановом брожении может быть использована барда, поступающая с ацетоно-бутиловых заводов, а также паточная спиртовая барда, являющиеся промышленными отходами. Паточная барда перед введением ее в среду должна быть предварительно нейтрализована растворами едкого натра или аммиака до pH 7,0—8,0. Оптимальной зоной pH, в которой процесс биосинтеза протекает наиболее активно, являются величины в интервале 6,8—8,5. Добавление одного процента метанола или этанола активирует метановое брожение и увеличивает выход витамина B12. Факторами, стимулирующими процесс брожения, являются продувание бродящей жидкости пропан-бутаном и углекислым газом.

В процессе биосинтеза витамин B12 остается внутри клеток и не переходит в питательную среду. Процесс брожения осуществляется в железном или железобетонном ферментаторе. В ферментатор из инокулятора поступает культура; затем ежедневно сливается 20% объема культуральной жидкости, а вместо слитой доливается новая в том же количестве. Бактериальная масса отделяется от среды осаждением или центрифугированием. В случае применения метода осаждения в качестве коагулянта используют хлорное железо. Выделенная биомасса сушится при температуре 110—120°. В зависимости от способа отделения биомассы витаминный состав меняется. Если биомасса отделяется посредством коагуляции хлорного железа, то на грамм сухого веса приходится 61 мкг витамина В12 и 35 миг рибофлавина. Если хлорное железо не применяется, то витамина В12 содержится 172 мкг/г и рибофлавина 69 мкг/г. Такие величины были получены Э. Д. Михлин, Н. П. Ерофеевой,

Н. В. Соловьевой и В. Г. Симоновой (1964) в опытах с биомассой, образующейся при метановом брожении ацетонобутиловой барды. Разумеется, абсолютные цифры зависят от технологических условий, от культур микроорганизмов, входящих в состав «активного ила». Помимо витаминов, биомасса содержит большое количество азотистых веществ. Как показали опыты по кормлению различных сельскохозяйственных животных, по усвояемости азота, содержащегося в биомассе, последняя эквивалентна необезжиренной соевой муке.

Изложенный способ имеет важные преимущества по сравнению с другими способами ферментации витамина для кормовых целей. Метановое брожение барды позволяет, наряду с получением витамина В12 и метана, значительно обезвредить сточные воды, сбрасываемые спиртовыми и ацетоновыми заводами, и тем самым улучшить санитарные показатели работы этих предприятий. Оно более экономично, так как не требует затрат на питательную среду (используются отходы); может идти в железных или железобетонных емкостях, вместо ферментеров из нержавеющей стали; не требует стерилизующих систем и расхода пара на стерилизацию среды. Процесс осуществляется непрерывным методом вместо периодического. В качестве побочного продукта получается значительное количество метана, который может быть использован как топливо.

 

 

12. Промышленное производство витамина В12

 

Получение медицинских препаратов. Пропионовокислые бактерии занимают одно из центральных мест среди продуцентов витамина. Природные штаммы синтезируют 1,0–8,5 мг/л корриноидов, промышленный мутант P. shermanii M-82, используемый в качестве продуцента, образует до 58 мг/л витамина.

Использование пропионовокислых бактерий .  В России медицинские препараты витамина получают  с использованием мутантных штаммов Propionibacterium shermanii и Propionibacterium freudenreicheii, которые способны синтезировать более 10 мг/л целевого продукта. Культивирование пропионовокислых бактерий осуществляется периодическим способом на средах сложного состава, содержащих кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта, сульфат аммония. Обязательным условием высокого выхода витамина является наличие в среде предшественника витамина — 5,6-диметилбензимидазола (23, 5,6-ДМБ). Выделение целевого продукта осуществляется экстракцией растворителем, сорбцией на ионитах, осаждением или сочетанием этих способов.

Исходную культуру поддерживают на твердой питательной среде следующего состава, г: глюкоза — 20, кукурузный экстракт — 20, аммоний сернокислый — 2, кальций углекислый — 20, вода — 1,0 л, рН среды после стерилизации — 6,8–7,0.

Далее готовят посевной материал путем последовательного размножения бактерий сначала в пробирках по 30 мл, затем в колбах по 500 мл и последовательно  в аппаратах емкостью 100 и 1000 л. Приготовление посевного материала проводят в анаэробных условиях  в течение 2–4 сут при 30 °С на среде аналогичного состава с добавлением 0,005 г хлористого кобальта. Предварительное выращивание культуры для производства витамина В12 занимает обычно до 18 сут.

Многоступенчатость этого процесса связана с большим расходом посевной культуры на засев (10–20 об. % от объема среды). В противном случае рост бактерий замедляется, что может привести к низкому уровню накопления витамина и заражению КЖ посторонней микрофлорой.

Заключительную ферментацию проводят также  в анаэробных условиях.

Ферментация проходит в две фазы. Первая длится 67 ч (с момента засева среды культурой бактерий до внесения 5,6-ДМБ) и протекает в строго стерильных условиях при 28–30 °С. При этом происходит размножение бактерий с интенсивным нарастанием биомассы (50–55 ч ферментации), сопровождаемое образованием пропионовой и уксусной кислот, которые нейтрализуются добавлением 40% раствора едкого натра или аммиачной воды, поддерживанием рН на уровне 6,5–7,0. В первой фазе Р. Shermanii накапливает в основном (80 % и более) не содержащий нуклеотидного основания предшественник витамина В12 (фактор В), а также некоторое количество полных корриноидов, в том числе кобаламин (8–10 %), псевдовитамин В12 и фактор А.

Трансформация этих продуктов в активную для человека и животных форму витамина В12 (кобаламин) происходит во второй фазе ферментации в результате внесения в среду 5,6-ДМБ (10–20 мг/л) в условиях аэрации (2 м3/ч). За это время фактор В и часть других аналогов витамина В12 переводятся в кобаламин, содержащий в нуклеотидной части молекулы добавленное азотистое основание. КЖ содержит к концу процесса до 30 мг/л витамина В12, накопленного в клетках бактерий.

Для экстрагирования витамина клетки нагревают при 80–120 °С в течение 30 мин при рН = 6,1÷8,5.

Превращения в кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоцианатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В12.

Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, Al2O3, активном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями.

Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, либо смесью этих фенолов с бензином, бутанолом, тетрахлоридом углерода или хлороформом.

Чистота кристаллического цианокобаламина — не менее 96 %. Выход продукта обычно составляет  50–60 % от его содержания в исходной культуральной жидкости.

Аэробная ферментация с применением Pseudomonas denitrificans [138]. Фирма «Мерк» использует один  из высокоактивных продуцентов рода Pseudomonas для промышленного получения витамина с помощью мутантного штамма Ps. denitrificants МВ 2436. Процесс состоит из трех стадий.

I. Посев лиофилизированной культуры  в пробирку  с агаризованной средой (рН = 7,4) состава:

Меласса	60 г
пекарские дрожжи	1 г
n-нитрозоамин	1 г
Диаммонийфосфат	1 г
сульфат магния	200 мг
сульфат цинка	20 мг
молибдат натрия	5 мг
Агар	25 г
Вода	1,0 л

 

Культивирование ведут 4 дня при 28 °С.

II. Приготовление посевного материала, для чего культуру смывают  с пробирки в 150 мл жидкой среды того же состава, но без агара. Культивируют в конических колбах объемом 1,0 л в течение 3 сут. при 28 °С  на роторной качалке.

III. На стадии основной ферментации  посевной  материал (150 мл) вносят в ферментер объемом 5 л, содержащий 3,3 л производственной среды с рН = 7,4,  в состав которой входят:

 

свекловичная меласса	100 г
пекарские дрожжи	2 г
диаммоний фосфат	3 г
сульфат марганца	5 г
сульфат магния	200 мг
нитрат кобальта	188 мг
сульфат цинка	20 мг
молибдат натрия	5 мг
5,6-ДМБ	25 мг
Вода	1,0 л

 

Ферментацию проводят в течение 90 ч при 28 °С, при непрерывном перемешивании (420 мин–1) и аэрации (0,2 м3/ч); накопление витамина достигает 59 мг/л.

Выделение и очистка продукта включают прогревание КЖ при 120 °С в течение 30 мин, перевод экстрагированного витамина в цианоформу (добавление цианистого калия), фильтрацию, двукратную экстракцию корриноидов органическими растворителями (смесь крезол : четыреххлористый углерод 1 : 2), хроматографию на оксиде алюминия.

Выход кристаллического цианокобаламина 98% чистоты составляет 75 % от его содержания в культуральной жидкости.

Получение кормовых препаратов [138] Высокой кобаламиносинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии рода Methanosarcina; особого внимания заслуживает галофильный штамм вида Methanococcus halophilus, который синтезирует более 16 мг корриноидов/1 г биомассы. Разработаны методы получения кормовых препаратов витамина В12. Широкое применение нашли два способа получения витаминных препаратов путем метанового брожения сложных питательных сред.

Мезофильный процесс основан на мезофильном метановом брожении экспериментально подобранной питательной среды следующего состава, кг/м3:

метанол	5,0
свекловичная меласса	3,2
сульфитные щелоки (70–80%)	2,0
кукурузный экстракт	1,6
аммиак (30% раствор)	1,0
аммоний углекислый	3,0
аммоний фосфорнокислый трехзамещенный (10% раствор)	2
магний хлористый	0,1
пивные дрожжи (сухие)	0,2
печень говяжья	0,002
янтарная кислота	0,006
глицин	0,006
натрий двууглекислый	0,02
кобальт хлористый	0,01
О-ксилидин	0,01
5,6-ДМБ	0,001

 

Пивные дрожжи служат источником витаминов (разд. 15.7.4). Перед внесением в среду их смешивают  с водой и кипятят 10 мин. Печень вводят в качестве источника ферментов, катализирующих образование  из глицина и янтарной кислоты предшественника витамина В12 d-аминолевулиновой кислоты. Печень измельчают и настаивают в течение 24 ч с водой при температуре +5 °С, затем добавляют глицин и янтарную кислоту, выдерживают смесь 2 ч при 35 °С и вводят  в среду.

Ферментацию проводят в заполненных на 90 %  емкостях объемом 500–1000 м3 при 35 °С, ежесуточно заменяя 10 % сброженной КЖ свежим субстратом. Выход корриноидов составляет 16–18 мг/л, из них 50–60 % приходится на долю истинного витамина В12 (кобаламина), 20–30 % — фактора Ш (5-оксибензилиндазол),  а остальное количество кобаминов представлено фактором В и другими аналогами. Путем увеличения концентрации некоторых питательных компонентов среды и совершенствования режимов ферментации можно повысить накопление корриноидов до 40 мг/л. Сброженную культуральную жидкость используют для получения медицинских и кормовых препаратов витамина В12, состав которых зависит от назначения и условий применения.