Определение витамина В12 в биологических объектах

Молекула витамина В12 состоит из двух частей: кобальтсодержащей (порфириноподобной) и нуклеотидной, содержащей 5,6-диметилбензимидазол. Характерные особенности первой части заключаются в наличии атома кобальта и цианогруппы, образующих координационный комплекс. Так же, как и порфирины, он состоит из четырех азотистых гетероциклов типа пиррола. Как у порфиринов, так и у гетероциклов витамина В)2 имеются одинаковые заместители — боковые цепи (—СН3 и —СН2—СН2—СООН группы). В отличие от порфиринов у витамина большее насыщение метальными группами.

Наряду с биосинтезом витамина В12, который носит название цианкобаламина, могут образоваться его производные: окси-, хлоро-, сульфато, нитрито-кобаламины, не уступающие по своей клинической эффективности цианкобаламину. Другие аналоги витамина B12 характеризуются тем, что в нуклеотидной части молекулы вместо 5,6-диметилбензимидазола содержится аденин или метиладенин, или их производные. Они не обладают биологической активностью для человека и животных и являются, следовательно, псевдовитаминами.

Преимущество получения витамина В12 пропионовокислыми бактериями по сравнению с актиномицетами заключается в том, что они синтезируют исключительно истинный витамин B12. Основные этапы биосинтеза витамина B12 разработаны Шеминым, а также В. Н. Букиным и Г. В. Проняковой (1958, 1960). Пути биосинтеза порфиринов и хромофорной части молекулы витамина В12 являются общими до определенного этапа. К порфиринам относится ряд весьма важных биологически активных соединений: хлорофилл, гемин, дыхательные пигменты и другие соединения.

Образование порфиринов тесно связано с другими реакциями метаболизма, в первую очередь, с реакциями цикла трикарбоновых кислот. Одно из промежуточных соединений трикарбонового цикла — янтарная кислота (сукцинат) в виде своего производного — сукцинил-коэнзима А дает начало новой цепи реакций, которую Шемин называет сукцинат-глициновым циклом. Начальной реакцией этого цикла является конденсация сукцинил-КоА с аминокислотой глицином по его α-углеродному радикалу. Возникающая α-амино-β-кетоадипиновая кислота, декарбоксилируясь, дает δ-аминолевулиновую кислоту. Два моля δ-аминолевулиновой кислоты (δ-АЛК) конденсируются с образованием монопиррола порфобилиногена.

В дальнейшем образуются порфириноподобные структуры, содержащие пиррольные кольца. У витамина В12 пиррольные кольца отсутствуют, имеются лишь их более восстановленные аналоги: одно тетрагидропиррольное или пирролидиновое (А) и три дигидропиррольных или пирролиновых кольца.

При изучении продуктов метаболизма Propionibacterium shermanii было обнаружено наличие в среде δ-аминолевулиновой кислоты и свободных порфиринов. Таким образом, эти данные являются подтверждением общности рассматриваемых путей биосинтеза. Введение в пептоновую питательную среду δ-аминолевулиновой кислоты способствует резкому увеличению синтеза порфиринов культурой пропионовокислых бактерий, но не сказывается на количестве синтезированного витамина. Введение параллельно с δ-аминолевулиновой кислотой хлористого кобальта приводит к образованию витамина. Дальнейшее увеличение концентрации соли кобальта приводит не только к синтезу витамина, но и к качественному изменению порфиринов. По всей вероятности, образуется Сопорфирин.

На среде с кукурузным экстрактом пропионовокислые бактерии практически совершенно не образуют порфиринов, а добавление δ-аминолевулиновой кислоты приводит к увеличению выхода витамина. Считают, что фактором, тормозящим биосинтез порфиринов и переключающим на синтез витамина, является железо. По всей вероятности, именно со стадии δ-аминолевулиновой кислоты намечаются расхождения в путях биосинтеза порфиринов и витаминов В12. В частности, возможно, что в молекулу витамина включается метилированная δ-аминолевулиновая кислота. Относительно метилирования имеются также данные о том, что источником метильных групп является метионин. Однако пока нет достаточных оснований говорить о том, происходит ли метилирование δ-аминолевулиновой кислоты и ее последующее включение в молекулу или метилируется уже сложившаяся структура витамина B12. Показано, что введение метионина в соевую среду стимулирует биосинтез. Синтез порфиринов тормозят пурины, а также аденинсодержащие нуклеотиды и нуклеозиды. Предполагают, что их введение в состав питательной среды вызывает подавление синтеза δ-аминолевулиновой кислоты, вероятно, по принципу обратной связи.

При биосинтезе пенициллина и эритромицина в питательную среду вводят «осколки» молекулы, которые затем целиком или значительной частью включаются в состав молекулы. Для биосинтеза витамина B12 в качестве такого «предшественника» является 5,6-диметилбензимидазол, который входит в состав молекулы в качестве нуклеотидного основания. Однако при введении этого компонента в среду стимулирующего биосинтез витамина эффекта не отмечается, если в среде отсутствует кобальт. Соли кобальта приходится специально вводить в среду, так как в комплексных средах кобальт может присутствовать в крайне незначительных количествах, в виде следов, едва доступных для аналитического определения.

Необходимо отметить, что соли кобальта относятся к довольно эффективным бактерицидным веществам. Поэтому при оценке влияния солей кобальта (чаще других используются хлорид или нитрат) необходимо избрать такую его концентрацию, которая не тормозит развития продуцента, но стимулирует биосинтез витамина. Концентрации кобальта в средах не являются абсолютными величинами и зависят от штамма.

Витамин В12 удалось синтезировать искусственно при помощи ферментного препарата, выделенного из Str. olivaceus. В систему компонентов входили: Na-соли кобальт-порфирина; 5,6-диметилбензимидазол; D-рибоза, DL-треонин, KCN, АТФ и ферментный препарат. Этот ферментный препарат не является каким-то одним ферментом, ответственным за заключительный этап биосинтеза молекулы витамина, так как перечисленные компоненты не все являются осколками или предшественниками молекулы. Вероятно, он содержит группу ферментов.

Биосинтез витамина B12 актиномицетами параллельно с антибиотиками. Биосинтез витамина B12 может осуществляться параллельно с хлортетрациклином, реже со стрептомицином. Имеются также указания, что витамин B12 образуется при ферментации нистатина и эритромицина.

Образование витамина B12 и антибиотиков протекает, как правило, почти параллельно. В первые часы ферментации (для Act. aureofaciens через 24 ч и Act. globisporus streptomycini через 48 ч), в период интенсивного образования биомассы, в среде обнаруживается незначительное количество витамина и антибиотиков, и лишь когда рост культуры прекращается, начинается интенсивное накопление этих продуктов обмена в культуральной жидкости. Подобный факт является важным в том отношении, что позволяет сочетать оба процесса, поскольку время окончания биосинтеза антибиотика совпадает по времени со значительным содержанием витамина B12.

При оценке влияния солей кобальта на биосинтез в опытах с культурами Act. aureofaciens и Act. globisporus streptomycini оптимальными пределами концентрации были 0,12—0,05 мг% (для нитрата кобальта). Введение свыше 0,25 мг% нитрата кобальта в среду для хлортетрациклина и 1,25 мг% в среду для стрептомицина угнетало образование витамина B12 и антибиотиков. В качестве исходного продукта для выделения витамина В12 при ферментации Act. aureofaciens используется маточный раствор после фильтрации кальциевой соли хлортетрациклина на фильтр-прессах. Получение кальциевой соли хлортетрациклина является одним из первых этапов выделения антибиотика из нативного раствора.

В связи с тем, что витамин В12 синтезируется параллельно с антибиотиками, проводилось изучение влияния ингибиторов на биосинтез эритромицина и витамина В12 Str. erythreus. Введение мышьяковистокислого натрия в среду понижало продукцию эритромицина на 90%, а продукцию витамина В12 — только на 20% по сравнению с такой же средой без ингибитора. Это показывает, что процессы синтеза витамина В12 и эритромицина протекают независимо друг от друга.

Направленный биосинтез витамина В12 пропионовокислыми бактериями и актиномицетами. Некоторые специальные штаммы пропионовокислых бактерий и актиномицетов являются продуцентами только витамина B12 и не синтезируют антибиотики. В промышленности предпочтительно используют пропионовокислые бактерии. Одной из существенных положительных сторон процесса является отсутствие аэрации. Известной трудностью является повышенное требование в соблюдении асептических условий процесса. При биосинтезе антибиотиков, особенно широкого спектра, образующийся в среде антибиотик оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие на постороннюю микрофлору. При биосинтезе витамина B12 опасность заражения значительно выше.

Наиболее элементарными приемами, обеспечивающими асептичность операции, являются тщательная стерилизация среды при ее приготовлении; тщательная стерилизация воздуха; защита паром вентилей, открывающихся в ферментер.

Наличие в среде 5,6-диметилбензимидазола способствует направленному синтезу истинного витамина, понижая до минимума или вовсе не включая наличие в микробной массе псевдоформ В. Г. Макаревич и Т. Н. Лазникова (1957) считают, что все псевдоформы витамина B12 могут быть, по-видимому, превращены в истинный витамин с помощью 5,6-диметилбензимиДазола, добавляемого в любой момент ферментации, даже после того, как культура уже закончила синтез. Для превращения псевдовитаминов В12 в истинный витамин B12 достаточно вести ферментацию дополнительно 12—24 ч после добавления 5,6-диметилбензимидазола. По Н. М. Нероновой, Н. Д. Иерусалимскому и А. И. Анчуровой (1962), лучшие результаты биосинтеза витамина В12 наблюдаются в том случае, если 5,6-диметилбензимидазол добавлялся через 72 ч после посева культуры. При добавлении 5,6-диметилбензимидазола через 96 ч после посева полного превращения псевдоформ в истинный витамин не наблюдалось.

При проведении биосинтеза с экспериментальными целями в среду вместо 5,6-диметилбензимидазола вводили аденин. Был получен псевдовитамин, содержащий в составе аденин. Если биосинтез осуществляется культурой актиномицета, то добавление 5,6-диметилбензимидазола в среду существенно не сказывается на выход витамина B12.

Биосинтез витамина B12 культурой Act. olivaceus проводится на средах, содержащих кукурузный экстракт или спиртовую барду, гидрол или крахмал, глюкозу, сульфат аммония, соли кобальта и мел. В развитии Act. olivaceus можно различить две фазы. В первую фазу накапливается основная масса мицелия. Синтез витамина В12 начинается в период начального роста организма, но значительно ускоряется после 24 ч. В этот период в мицелии может накапливаться до 40% от максимального количества витамина в культуре. В первой фазе, в течение первых суток происходит интенсивная диссимиляция глюкозы. От исходного pH 7,0 в этот период величина pH понижается до 6,5—6,8. Во вторую фазу развития культуры, когда практически нет роста мицелия, синтезируется основное количество витамина B12. В этот период, во вторую фазу, среда становится щелочной (pH 8,2—8,7). Общая продолжительность процесса ферментации составляет 72—96 ч.

Для хорошего роста актиномицета и стимуляции образования витамина необходимо перемешивание и аэрация среды. Усиленная аэрация способствует повышенному биосинтезу витамина В12. Это повышение биосинтеза происходит не только за счет увеличения биомассы, так как прямой зависимости между ростом актиномицета и накоплением витамина нет. Количество биомассы может быть практически одинаковым в различных условиях аэрации, в то время как биосинтез витамина при усиленной аэрации протекает более интенсивно. Интенсивность аэрации (в известных конкретных производственных и технологических условиях) может способствовать ускорению процесса ферментации. Интенсивная аэрация способствует также направленному биосинтезу витамина B12, значительно понижая количество псевдовитаминов в культуральной жидкости.

Оптимальными пределами температуры для развития культуры и биосинтеза витамина В12 является 28—30° С. Верхний температурный предел для синтеза витамина равняется 32°. Существенное значение для хорошего выхода витамина В12 имеет определенная концентрация в среде солей кобальта.

Пропионовокислые бактерии могут культивироваться как в совершенно анаэробных, так и в аэробных условиях. Они не могут расти в сильно аэрируемых средах. Культивирование может проводиться на средах, содержащих кукурузный или дрожжевой экстракты, глюкозу, сульфат аммония, соли кобальта. Процесс ферментации продолжается больше времени, чем у актиномицетов, до 96 — 120 ч. В культуре пропионовокислых бактерий витамин удерживается внутри клеток на протяжении всего процесса ферментации в отличие от культуры Act. olivaceus, где уже через 24 ч после засева начинается диффундирование витамина в среду. Рост биомассы пропионовокислых бактерий наблюдается на протяжении всего процесса ферментации, так как в среду систематически в асептических условиях вводится стерильный раствор глюкозы. Наибольшая продуктивность бактерий в отношении витамина B12 отмечается у молодой культуры, продуктивность вновь образующихся клеток в старой культуре значительно ниже. Имеется прямая зависимость между биомассой и количеством синтезированного витамина. В дальнейшем по ходу ферментации увеличение количества витамина происходит не за счет усиления процесса биосинтеза, а исключительно за счет увеличения бактериальной массы.

В отличие от пропионовокислых бактерий у Act. olivaceus синтез витамина примерно на 24 ч отстает от роста организма. Наиболее интенсивное накопление витамина у Act. olivaceus происходит после того, как мицелий, достигнув определенной степени развития, переходит в стадию автолиза.

Для роста Propionibacterium shermanii наиболее благоприятной является нейтральная среда, поэтому по ходу процесса ежедневно, а иногда и чаще производят нейтрализацию образующихся кислот. Оптимальной зоной pH для роста является зона между 6,3—7,5. Наибольшее количество витамина В12 накапливается в средах, где pH культуральной жидкости поддерживался на уровне 6,8—7,5. Значительно худшие результаты были получены, когда процесс шел при более низких величинах pH. Выход витамина оставался пониженным даже в том случае, если после 72 ч pH повышалось до 6,8 и 7,5. Таким образом, активный биосинтез витамина В12 происходит в довольно узкой зоне pH, а рост бактерий происходит при значительно более широких интервалах pH.

Наибольшее количество витамина В12 образуется при культивировании бактерий в исключительно анаэробных условиях. Особенно вредное влияние на биосинтез витамина В12 оказывает выращивание бактерий в аэробных условиях в течение первых 50 ч. Что касается роста, то при аэробных условиях бактерии накапливают не меньше биомассы, чем при анаэробных.