Определение витамина В12 в биологических объектах

Условия разделения и результаты

При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера на силикагеле цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 1), а водой перемещается (Rf * 100 е^22).

 
Обнаружение и возможности определения

 

ВИТАМИН	Rf * 100		ОКРАСКА			ГРАНИЦЫ ОПРЕДЕЛ
	Уксусная кислота-ацетон, метанол	вода	В УФ-свете (254мм)	в УФ-свете (365мм)	дневной свет
В12(циклокобаламин)	0	22	Тёмная	фиолетова	красная	1-0,5-0,3

Таблица 1. Ориентировочная величина Rf x 100 и непосредственное обнаружение 
витамина В12 с использованием различных источников освещения 
на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой

 

 

Рис. 2. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов. 
Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около 40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 — 30 мг тиамина • НС1; 2 — 3 мг рибофлавина;7—10 дг цианокобаламина

 

Для идентификации относительно больших количеств цианкобаламина можно рассматривать подобную хроматограмму при различном освещении. При дневном свете по красной окраске можно определить еще 0,3 мг, в Уф-свете при длине волны 365 мм — 0,5 мг и при длине волны 254 мм — 1 мг в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. После хлорирования и опрыскивания раствором о-толидин — иодид калия (реактив № 32) можно еще обнаружить даже 0,2 мг в виде фиолетовых пятен. Для микроопределения следует также использовать биоавтографию.

 

 

6. Определиние витамина В12 иммуноферментным методом

 

Поскольку содержание кобаламинов в организме крайне незначительно, определение их возможно современными высокочувствительными методами - радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой. Применяют твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12. Поскольку витамин В12 является гаптеном, для проведения иммуноэнзимного анализа требуется получение конъюгатов этого соединения с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное. Ниже приводится описание метода по получению конъюгатой Альб- В12.

10 мг карбоксилатного производного  цианкобаламина (7 мкмоль) растворяют  в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляют по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль). Реакционную смесь инкубируют в темноте в течение 2-х суток витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином юобавляют к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводят в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализируют в темноте при 4°С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции (соответственно цианкобаламина). Степень модификации БСА цианкобаламином определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при L=550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получают из конъюгатов Альб-В12, определяя их концентрацию спектрофотометрически. В данной системе был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина. Количество связавшихся антител определяют, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Проводят работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже приводятся условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА в течение первых 3-х часов при 37 0С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты отмывают несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревают при 100 0С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом /ДТТ/ для перевода всех дериватов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Используют следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл - для витамина В12 и 20нг/мл.

Стандартные растворы и испытуемые образцы - 0,1 мл - помещают в специальные пробирки и добавляют по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывают крышечками из фольги и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждают и вносят по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводят в течение 12-14 часов при 4-60 , после чего планшеты снова отмывают, а затем вносят соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000. Планшеты снова помещают в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывают ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещают в термостат на 2 часа, снова отмывают ФСБ и затем добавляют 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляют 4% H2SO4. Результаты спектрофотометрируют на при L=450 nm. На основании стандартных разведений строят кривую, по которой затем определяют концентрацию исследуемого соединения(В12) в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании данного метода.

 
 

Всего определение витамина было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700± 150 мг/мл (350-900).

 

 

7. Определение в растворах

 

Растворы, содержащие в 1 мл 0,03 мг, и растворы, со-0,1; 0,2; 0,5 или 1 мг в -1 мл, предварительно водой в .отношении 1:2, 1:4, 1:10 и 1:20, помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя в 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 361 нм. 
Содержание цианокобаламина в миллиграммах в 1 мл (х) вычисляют по  формуле: 

X=(E*10*v)/201

 

Где, v — разведение, 10— постоянный коэффициент, Е— найденная оптическая плотность.

Колориметрический метод

Испытуемый раствор наливают в кювету метра с толщиной слоя 1—2 см и находят величину оптической плотности раствора (зеленый светофильтр). По найденной величине, пользуясь калибровочным графиком, устанавливают содержание витамина В12 в 1 мл раствора прямым путем. 
Для построения калибровочного графика берут растворы чистого кристаллического цианокобаламина, содержащие 0,02; 0,025; 0,03; 0,035; 0,04; 0,045; 0,05; 0,055; 0,065 и 0,07 мг в 1 мл и определяют оптическую плотность этих растворов.На оси абсцисс откладывают содержание витамина B12, а на оси ординат—соответствующие плотности.

 

 

8. Определение В12 в кристаллическом препарате

 

Около 0,02 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 500 мл и доводят водой до метки. Определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, употребляя в качестве контрольного раствора воду.

Содержание витамина В12 а процентах (х) рассчитывают по формуле:

 

X=(c*500*100)/(207*100*a)

 

Где С – оптическая плотность раствора, а – навеска в граммах, 50 – разведение в мл, 100 – постоянный коэффициент, 100 – пересчёт в %.

 

 

9. Определение цианокобаламина c Escherichia coli в дражже или таблетках (применение биологических методов)

 

Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим методом с Escherichia coli 113-3 в качестве тест - микроорганизма.

Точную навеску   порошка   растертых   драже,   таблеток   или количество таблеток,  покрытых  оболочкой,  растертых  в  порошок, указанное   в   соответствующих   частных  статьях,  количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и  доводят объем  раствора  водой  до  метки,  перемешивают  и фильтруют.  Из полученного раствора делают разведение 1% раствором натрия цитрата с таким расчетом,  чтобы концентрация раствора  для  анализа  была близкой   к  контрольной  концентрации  раствора стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл.

В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой  и  3 чашки  для  раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским  дном,  установленные  на  горизонтальном  столе, отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной и охлажденной  до  температуры  48-50  град.  С  основной   среды, засеянной  суспензией  Е.  coli  113-3  из  расчета  от  4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной  среды.  После  застывания  среды  на каждой  чашке  стерильным  бором  делают по трафарету под углом 60 град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм. В три лунки (через одну) 6 чашек,  используемых для построения стандартной  кривой,  и  3  чашек  -  для   раствора   испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через одну)  каждых  3  чашек  вносят  по  0,1  мл одной из концентрации остальных растворов Государственного стандартного образца, а также  раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при  37 град.  С от 16 до 18  ч.  После  этого  измеряют  диаметры  зон стимуляции роста тест -  микроорганизма  для  каждой  концентраций  растворов стандартного образца. После измерения  зон  роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны,  учитывая в каждом случае 3 чашки,  т. е. 9 зон,  затем  рассчитывают  среднюю  величину  зоны для контрольной  концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.  По разности   между   средней   величиной   зоны   контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл),  выведенной из всех чашек,  и средней   величиной   зоны   контрольной   концентрации   раствора Государственного стандартного образца,  выведенной из  3  чашек  с каждой  отдельной концентрацией,  находят поправку к величине зоны  данной  концентрации.  Найденную  поправку  прибавляют  к  средней  величине  зоны  данной  концентрации,  если  она положительная,  и  вычитают,  если она  отрицательная.  Аналогичным  образом  делают  поправку к концентрации раствора испытуемого препарата. Содержание С63Н88СоN14О14Р (цианокобаламина) в одном драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

 

 

                              С х б х К

                        Х = -------------,

                            а х 1 000 000

 

 где С  -  содержание  цианокобаламина в 1 мл испытуемого  раствора,найденное по стандартной  кривой,  в микрограммах;  К - коэффициент  разведения; а  -  навеска  препарата  в  граммах  или   количество  таблеток,  покрытых  оболочкой;  б  - средняя масса одного драже в граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы.

 

 

10. Выделение В12 из микробной массы и животных тканей

 

Витамин В12 кристаллизуется в виде темно-красных игл или призм. Цвет варьирует от величины кристаллов. Кристаллографические измерения показывают, что кристаллы относятся к орторомбической системе и имеют призматическую форму. При кристаллизации из водного раствора и из смеси воды с ацетоном они содержат значительное, но изменчивое количество непрочно связанной кристаллизационной воды. Ее можно удалить нагреванием при пониженном давлении, причем кристаллы не теряют своей формы. После этого обезвоженный материал может снова поглощать влагу из атмосферного воздуха в количестве 10-12%; это и есть тот продукт, который обычно выпускается под названием витамина В12 и зарегистрирован в фармакопеях Англии и США. Витамин В12 довольно хорошо растворим в воде (около 1,2% при комнатной температуре), а также в низших спиртах, в низших алифатических кислотах и в фенолах, но нерастворим во многих других органических жидкостях. Он практически не растворяется в пиридине и других третичных аминах, но растворим в некоторых жидких или расплавленных амидах, например в ацетамиде и диметилформамиде. Витамин является левовращающим веществом, но интенсивная, окраска затрудняет измерение оптического вращения. Витамин В12 обладает диамагнитными свойствами, что указывает на трехвалентное состояние кобальта. Обычно витамин выделяют из микробной массы или животных тканей, используя растворы, содержащие цианид-ионы, играющие роль шестого лиганда кобальта. Однако сам цианкобаламин метаболически не активен. В состав ферментов входит соединение, в котором цианогруппа замещена остатком 5-дезоксиаденозина или метальным радикалом.

 

 

11. Биосинтез витамина В12

 

Биосинтез витамина B12 осуществляется специальными культурами, к числу которых могут быть отнесены актиномицеты (Act. olivaceus, Act. griseus, Act. aureofaciens, Act. fradiae), а также бактерии (Вас. megatherium, Lactobacillus casei, Clostridium tetanomorphicum, пропионовокислые бактерии). Наибольшее промышленное значение имеют Act. olivaceus и Propionobacterium shermanii.

Наиболее активными продуцентами витамина являются пропионовокислые бактерии (Propionibacterium), некоторые представители рода Pseudomonas и метаногенные бактерии. В промышленности производятся препараты витамина двух видов: витамины для медицинских целей и кормовые препараты.

Из примерно 10 т ежегодно выпускаемого в мире витамина В12 3,5 т приходится на цианокобаламин, 2 т на оксикобаламин, 1 т на коэнзим В12 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы используются в медицине . Остальное количество витамина применяется в животноводстве. По другим данным производство витамина В12составляет около 20 тыс. т.

Помимо биосинтеза витамина В12 специальными продуцентами, существуют методы получения витамина параллельно с антибиотиками, в частности с хлортетрациклином. Получение витамина B12 микробиологическим путем экономически значительно выгоднее, чем из животного сырья, где в качестве исходного продукта используют печень.