Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности

Однако, во всех цитированных работах изучалось связывание с лейкоцитами свободного ЛПС, но не изучено связывание ассоциированного на частицах. Оценка связывания ЛПС лейкоцитами и, в частности лимфоцитов, может служить интегральным показателем состояния СИ, так как при этом оценивается состояние их рецепторного аппарата.

Для приготовления ЛПС-диагностикума - частиц мы к 1 мл эритроцитов, фиксированных и активированных 2,5% раствором глютарового альдегида, добавляли 5 мл 0,01% раствора ЛПС (S. flexneri) и инкубировали 30 мин при 37°С. Затем эритроциты отмывали 2 раза фосфатным буфером и использовали в качестве диагностикума в реакции розеткообразования с суспензией лейкоцитов крови здоровых и больных.

Уровень ЛПС+-лимфоцитов у здоровых лиц был высоким — 51,4±8,6%, что указывает на то, что его связывали не только В-лимфоциты для которых он служит митогеном, но и Т-клетки.

Уровень лимфоцитов, несущих рецепторы к липополисахариду бактериальной стенки, — является интегральным показателем состояния функции защиты системы иммунитета от бактериальной инфекции. Имеется связь содержания ЛПС+-лимфоцитов с длительностью клинических симптомов заболевания. При выздоровлении их относительное количество в крови составляло 40–56%. Оно достоверно не уменьшалось при атопической бронхиальной астме и других аллергических заболеваниях. В остром периоде заболеваний, ассоциированных с инфекцией, характерно было их снижение до 30– 36%, которое в периоде реконвалесценции возвращалось к норме. При рецидивирующих тяжелых гнойно-септических заболеваниях снижение может достигать 22–30% и длительно сохраняется в периоде ремиссии (рис. 1).

 

Следовательно, определение уровня ЛПС+- лимфоцитов позволяет оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета, снижение их экспрессии указывает на инфекцию и имеет прогностическое значение.

 

1.2.7. Особенности фенотипа лимфоцитов в норме и при заболеваниях

В норме при определении Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций с помощью мАТ авторы приводят значительно отличающиеся показатели нормы, в том числе и возрастной. Диапазоны верхних и нижних границ показателей нормы, приводимых лабораторией С.-Петербурга, существенно различаются. Это связано как с указанными особенностями методов выявления клеточных субпопуляций, так и с их высоким динамизмом в крови. У 6–10% здоровых людей имеются в норме значительные отклонения показателей от сред- них величин: у 9% людей количество лимфоцитов 42% у 8% лиц, ЕК>20% у 3% людей и т.д.

Уровни субпопуляций лимфоцитов изменяются при стрессе, физической нагрузке, при всех заболеваниях, под влиянием лечения различными препаратами. У детей раннего возраста имеется физиологический лимфоцитоз и связанный с ним отличающийся состав субпопуляций лимфоцитов.

Однако, как правило, динамика субпопуляций лимфоцитов в крови больных отражает тяжесть течения заболевания и по их составу можно осуществлять его прогнозирование.

При большинстве заболеваний снижается уровень CD3+- и CD4+-лимфоцитов. Нередко при хронических воспалительных заболеваниях повышается уровень CD25+-Т-лимфоцитов, что указывает на их активацию. Снижение этой и увеличение HLA-DR субпопуляции указывает на благоприятную динамику процесса. При герпетических и других вирусных инфекциях снижается уровень Тх и Тс, а также количество лимфоцитов, возникает иммунодефицитный лимфоцитопенический синдром.

Уменьшение уровня Т-лимфоцитов и Тх отмечается и при бактериальных инфекциях уже потому, что нередко они возникают на фоне вирусных. Кроме того, Тх чувствитель- ны к бактериальным токсинам в большей степени, чем В-лимфоциты. Уровень CD8+-кил- леров может быть повышен.

На основании повышенного уровня активированных CD3+DR+-лимфоцитов более 5% и увеличения (>3200 кл/мкл) или снижение (< 1200 клеток/мкл) делается прогноз развития герпетической инфекции.

Острое воспаление сопровождается следующим фенотипом лимфоцитов: CD3-, CD4+ или CD8-, CD4/CD8N или -, СВ25-, CD69-, CD16+ CD56+ N или Ї. При бактериальных инфекциях преобладает развитие гуморального ответа по Тх2 типа, однако у части лиц по Тх1 типа с ГЗТ. Подострое или затяжное воспаление с благоприятным течением характеризуется нормализацией показателей статуса.

Фенотип лимфоцитов связан с типом иммунной реакции: при гуморальном ответе с участием Тх 2 имеются активированные В- клетки, в лимфоидных органах и слизистых оболочках много плазматических клеток, а в крови — антитела разных изотипов. Причем при первичном ответе IgM, при вторичном — IgG (субклассы), а при аллергичес- ком — IgE. В иммунный ответ с участием сли- зистых оболочек вовлекаются клетки местно- го иммунитета и отмечается синтез секреторных IgA-антител.

Клеточный ответ с преобладанием активности Тх 1 типа характеризуется появлением Т-киллеров, которыми могут быть CD8+-Т- лимфоциты и потомки CD4+-клеток.

По изменению фенотипа клеток и других показателей СИ можно прогнозировать течение патологического процесса.

 

1.2.8. Иммунодиагностика патологии и аномальный иммунный ответ

 Специфическая иммунодиагностика основана на классическом выявлении иммунной реакции, особенно ее вторичного ответа: по наличию антител класса G против какого-то антигена, хотя первичный ответ в типичной ситуации сопровождают антитела класса М и их определение может иметь большее диагностическое значение. Часть антител связывается антигеном, образуя иммунные комплексы. Другая — сорбируется лейкоцитами — лимфоцитами, гранулоцитами, моноцитами- макрофагами, тромбоцитами и, по-видимому, эндотелием сосудов. Даже при нормальном иммунном ответе выявляются лишь свободные антитела и в основном класса G — субклассы G1, G2, реже G3 и G4.

Патологический, аномальный иммунный ответ встречается примерно у 10% индивидов. Его патологичность и аномальность может выражаться в следующем:

- агаммаглобулинемия — дефицит синтеза всех иммуноглобулинов

- дефицит синтеза G1, G2 и, как следствие  компенсации, — появление антител IgM, IgA, не определяемых в тех  тестах, которые используются для выявления IgG, например, ИФА

- дефицит синтеза IgM

- гиперпродукция IgE — как следствие ал- лергического аномального ответа

- синтез «неполных» антител, не  выявляемых в том или ином  тесте 

- наличие анти-Ig-нов, препятствующих определению антител

- низко- и высокодозовая толерантность к антигену и подавление ответа — аллергия

- диссоциация иммунного ответа — угнетение синтеза антител на фоне гиперактивности иммунных Т-лимфоцитов

- супресия иммунного ответа из-за активации специфических супрессоров

- дефицит соответствующих хелперов

- другие причины, ведущие к недостатку антител к данному антигену

Во всех перечисленных ситуациях аномального иммунного ответа можно не вы- явить антитела к конкретному антигену и сделать вывод о его отсутствии. Между тем, ситуации при этом наиболее тяжелые, патологические. Следовательно, иммунодиаг- ностика, ориентированная на однократное определение узкого спектра антител одного изотипа только в сыворотке крови и толь- ко одним серологическим тестом заведомо не позволяет определить наиболее аномальный иммунный ответ в наиболее драматических ситуациях.

Важнейшую часть иммунопатологии составляют аллергические заболевания и иммунодефициты. Обращает на себя внимание, что если аллергические и инфекционные заболевания четко связаны с участием в иммунном процессе конкретных, облигатных аллер- генов и инфектов, т.е. по существу являются антигенспецифическими, то иммунодефици- ты в этом отношении являются преимущественно антигеннеспецифическими.

Основа иммунодефицита — угнетение или полное недоразвитие какого-либо звена СИ, чем и объясняется недостаточность защиты и развитие инфекций, вызываемых различными условно-патогенными микроорганизмами. Правда, при любой форме ИД могут встречаться наиболее распространенные виды возбудителей, однако в целом характерно их разнообразие. Диагностика базируется на оценке иммунного статуса по многим показателям СИ, для выявления в ней дефектного звена.

3. . Оценка фагоцитоза и факторов врожденного иммунитета

 Функция фагоцитоза является важным показателем состояния системы гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, так как это — главный неспецифический механизм антибактериальной защиты. Снижение показателей фагоцитоза характерно при соответствующих иммунодефицитах, повышение — при благоприятном течении инфекции.

1) Оценивается поглотительная и переваривающая активность гранулоцитов с определением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Фагоцитарный индекс (ФИ) — это количество фагоцитов, участвующих в фагоцитозе (норма — 60–80%). Фагоцитарное число (ФЧ) — это среднее количество частиц или микроорганизмов в одном фагоците (норма 3–8). Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется.

Переваривание бактерий можно оценивать путем посева лизатов лейкоцитов на питательные среды и подсчета выросших колоний. Метод предполагает использование в качестве объекта фагоцитоза живых микроорганизмов. Переваривающую активность фагоцитов оценивают по числу выросших колоний.

Переваривание кандид (киллинг): оценивают киллинг в % убитых клеток через 30 и 60 мин минут инкубации. Подсчитывают при световой микроскопии процент убитых фагоцитами, окрашенных синькой, дрожжевых клеток. В норме киллинг состовляет 23–30%. Исследование этих показателей в динамике позволяет оченить скорость лизиса поглощенных клеток. Повышение ФИ и ФЧ при сохраненном киллинге указывает на снижение скорости лизиса дрожжевых клеток. Уменьшение ФИ и ФЧ при сохраненном киллинге указывает на интенсивный лизис дрожжевых клеток.

2) Метаболическую активность фагоцитов  определяют после окраски их 0.25% раствором нитросинего тетразолия. В норме окрашивается 12–21% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40% и более.

3) Система мононуклеарных фагоцитов (моноцитов и макрофагов) осуществляет и другие функции, важные для различных этапов иммунного ответа, в том числе распознавание и представление антигена. Для врожденного иммунитета определяющим является состояние (количество, степень родства) ЛПС-х и др. Для приобретенного — экспрессия антигенов дифференцировки, активации и адгезии (СD14, СD11, СD16, СD18, HLA-DR и др.), рецепторов к С3-комплементу, и Fc-рецепторов к иммуноглобулинам. Состояние функций оценивается по спонтанной и направленной миграции, способности секретировать цитокины (ИЛ-1, ФНОa и др.).

1.4. Характеристика гуморальных  факторов естественного иммунитета

 Факторы системы комплемента, b-лизины, интерфероны, маннан-связывающий белок, дефензины и белки острой фазы воспаления (СРБ, фибриноген, сывороточный амилоид, a2 - макроглобулин) служат первой линией защиты от патогенов и их недостаточность может быть причиной инфекции. Снижение уровня СН50 может наблюдаться как вторичное состояние при инфекционных заболеваниях ЛОР-органов и бронхов. Рецидивирующую инфекцию дыхательных путей пневмококковой этиологии связывают с дефицитом С3 компонента комплемента.

1) Гемолитическая активность комплемента  определяется в реакции гемолиза  с использованием гемолитической системы. Определение комплемента основано на способности продуктов его активации вызывать лизис эритроцитов, покрытых антителами. По степени гемолиза судят о гемолитической активности комплемента. В качестве единицы измерения комплемента используется 50% единица (СН50) — количество комплемента, вызывающее 50%-ный лизис 0,5 мл стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов при температуре 370 С в течение 60 мин.

2) Выявляют продукты активации  С4а, С3а, С5а и др.

3) Оценивают количество компонентов  комплемента (норма в сыворотке  крови в мг/л: С1q-190, C1s-120, С2–30, С4–430, С3–1300, С5–75, С6–60, С7–55, С8–60, С9–160, пропердин-25, фактор В-240, С1-ингибитор-180).

4) С помощью антител выявляют отложения комплемента с иммунными комплексами в биоптатах тканей.

5) Определяют рецепторы на лейкоцитах, связывающие С3 и другие компоненты комплемента.

1.5. Специфические показатели  иммунного статуса и методы  их определения

 Антигенспецифические методы широко используются для диагностики инфекций, аутоиммунных и аллергических заболеваний, патологии репродукции, реакций отторжения трансплантантов, опухолей.

Для оценки специфических показателей используют 3 группы методов:

1) Методы определения антител  различных классов (G, М, А, Е, D) к определенным антигенам. Эти методы используются при оценке типа динамики иммунного ответа и позволяют выявить дефицит секреции антител какого-либо определенного класса или субклассов иммуно- глобулинов. При рецидивирующих заболеваниях органов дыхания наиболее часто определяются дефициты IgG1 , IgG3 , IgA и sIgA- антител к пневмококку, гемофильной палочке и ряду других микроорганизмов.

2) Методы выявления иммунных Т-лимфоцитов, несущих рецепторы к определенному антигену, позволяют оценить сенсибилизацию к ним организма. Кожные пробы к PPD позволяют оценить замедленную гиперчувствительность к микобактериям туберкулеза. В клеточных тестах (бласттрансформации, угнетения миграции, стимуляции секреции цитокинов) можно оценить наличие иммунных лимфоцитов к данному антигену.

3) Методы обнаружения инфекционных  антигенов, подтверждающих этиологию  заболевания.

1.6. Значение показателей  иммунного статуса (иммунограмм)

 Все показатели оцениваются  комплексно в связи с анамнезом и клиническими данными больного. Формула крови при иммунодефицитной болезни (ИДБ) обычно изменена и в связи с инфекцией может быть лейкоцитоз, ус- коренная СОЭ, нейтрофиллез (нейтропения), моноцитоз, эозинофилия. Количество лимфоцитов увеличено или понижено, причем много крупных (более 10 мкм в диаметре — активированных). Внутрикожные тесты с распространенными антигенами отрицательны (у детей — малозначимо). При многих ИД процентное и абсолютное число Т-лимфоцитов понижено на 15% и более. Небольшое снижение их уровня наблюдается при многих заболеваниях и нормальном иммунном ответе (например, на вакцины) и не указывает на ИД. Соотношение CD4/CD8 уменьшено, пролиферативная, цитотоксическая активность Т-клеток угнетается. Цитокиновая активность может быть пониженной или повышенной. Уровни интерферонов чаще снижаются, но могут повышаться.