Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности

 

	Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина	Реферат   2015
		Лист /22

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат на тему:

«Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание:

 

Введение……………………………………………………………………………………..3

1. Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах…………………………………..…3
2. Принципы иммунофенотипирования лимфоцитов……………………………………..8
1. Особенности иммунофенотипирования лимфоцитов методами лазерной проточной цитометрии………………………………………………………………………8
2. Фенотипирование лимфоцитов с частицами, покрытыми моноклональными антителами……………………………………………………………………………...10
3. Иммунофенотипирование лимфоцитов иммуноферментным методом………....11
4. Иммуномагнитное выделение лимфоцитов как метод их фенотипирования…...11
5. Лимфоцитотоксический тест……………………………………………………….12
6. Характеристика связывания липополисахаридов бактерий лейкоцитами для оценки иммунного статуса……………………………………………………….....12
7. Особенности фенотипа лимфоцитов в норме и при заболеваниях………………14
8. Иммунодиагностика патологии и аномальный иммунный ответ……………….15
3. Оценка фагоцитоза и факторов врожденного иммунитета……………………………..16
4. Характеристика гуморальных факторов естественного иммунитета………………….17
5. Специфические показатели иммунного статуса и методы их определения…………..18
6. Значение показателей иммунного статуса (иммунограмм)……………………………..18

Заключение………………………………………………………………………………....21

Список использованной литературы……………………………………………..………22

 

Введение

Для того чтобы грамотно и квалифицированно диагностировать болезни врач-клиницист должен в достаточной степени знать сущность и значение основных иммунологических параметров организма в норме и патологии, определяемых современными методами.

Все современные показатели иммунного статуса можно разделить на 2 группы: антигенспецифические и антиген-неспецифические. Эти методы используют для оценки иммунного статуса, т.е. для характеристики состояния системы иммунитета (СИ).

Для оценки иммунного статуса при иммунодефицитах используются преимущественно антигеннеспецифические методы, а для диагностики инфекционных заболеваний и аллергии — антиген(аллерген)-специфические. Имеются четыре основных группы антиген-неспецифических методов:

1. Количественная характеристика  популяций и субпопуляций лимфоцитов и других лей- коцитов методами иммунофенотипирования клеток по рецепторам, CD-антигенам и другим маркерам.

2. Анализ функций клеток СИ (т.е. лейкоцитов) — пролиферативной, секреторной, цитокиновой, цитотоксической.

3. Определение медиаторов и цитокинов, продуцируемых клетками, в биологических жидкостях.

4. Определение гуморальных факторов  системы иммунитета (иммуноглобулинов, комплемента и др.)

 

1. Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах

Количество методов, необходимых для полноценной характеристики состояния системы иммунитета, быстро увеличивается параллельно сложности их выполнения. Поэтому применение тестов I и даже II уровня для оценки иммунного статуса недостаточно эффективно. Концепция иммунологического образа болезни, обосновывающая существование для каждого заболевания и его вариантов своих измененных параметров, а также ориентировка на вид и вариант иммунного статуса, позволяет использовать небольшую группу главных диагностических показателей в каждом конкретном случае.

Лабораторная диагностика иммунодефицита (ИД) основывается на определенной последовательности, алгоритме действий, используемых при оценке иммунного статуса. Выявление ИД проводят в двух ситуациях:

1) при скрининге контингентов населения определенных регионов и рабочих коллективов на предмет наличия ИД;

2) при обследовании больных с целью уточнения предварительного диагноза. Для некоторых генетических обусловленных иммунодефицитов возможна пренатальная диагностика на основании ультразвукового обследования, хромосомного и биохимического анализов. Эпидемиологические скрининговые обследования различных групп населения и больных на наличие иммунодефицитов проводятся по следующей примерной схеме.

1. Анамнез и осмотр. Заполнение  анкет. Их анализ, формирование групп  риска с предвари- тельным диагнозом  по основным синдромам.

2. Клинико-лабораторное обследование. Основные показатели крови и биохимический статус (объем по показаниям). Предварительный диагноз иммунопатологии (вариант иммунного статуса). Рекомендации по набору тестов для оценки иммунного статуса.

3. Оценка иммунного статуса (наиболее распространенные тесты):

3.1. Общий анализ крови; определение соотношении нейтрофилы/лимфоциты/моноциты. СОЭ, СРБ, белковые фракции сыворотки крови (g-глобулины).

3.2. Определение количества Т-лимфоцитов (процент и абсолютное число) методами с моноклональными антителами (мАТ) антителами к CD2, CD3, CD4, CD8, CD25. Отношения CD4/CD8.

3.3. Определение В-лимфоцитов — CD19, CD21, CD22, CD72 или Ig+B.

3.4. Определение иммуноглобулинов  классов G, М, А, Е в сыворотке крови и sIgA слюне. Соотношения их количества (G/M/A).

3.5. Поглотительная активность нейтрофилов крови, частиц латекса и/или стафилококков, кандид (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс); оценка киллинга кандид, бактерий.

3.6. НСТ-тест.

3.7. Определение циркулирующих иммунных  комплексов (методом ПЭГ-осаждения). Другие тесты по показаниям.

3.8. Антитела против стрептококка, дифтерийного токсина, гемофильной палочки, столбнячного токсоида, стафилококка, его токсина и вирусов (кори, гриппа).

3.9. Определение гемолитической  активности комплемента (С50) и/или  его компонентов.

3.10. Внутрикожные пробы (после забора крови!) с распространенными антигенами (туберкулин, стрептокиназа-стрептодерназа, антигены бактерий и грибов).

3.11. По показаниям—определение ферментов, отсутствующих при первичных иммунодефицитах (АДА, пуриннуклеозидфосфорилазы, альфафетопротеин при атаксии; гранулы лейкоцитов при гранулематозной болезни).

3.12. Оценка интерферонового статуса: концентрация интерферона в сыворотке крови; уровень интерферонa а и g в культуре лимфоцитов крови после стимуляции вирусом болезни Ньюкастла и стафилококковым энтеротоксином соответственно.

3.13. HLA-типирование (при необходимости).

3.14. Выявление цитокинов (по показаниям), в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в клетках системы иммунитета (СИ) методами проточной цитометрии.

3.15. Определение общей g-цепи рецепторов цитокинов при тяжелом комбинированном иммунодефиците (ТКИД) методом проточной цитометрии.

Основные показатели лимфоидной системы

Среди различных методов ОИС центральным является определение фенотипа популяций и субпопуляций лимфоцитов.

Фенотипирование лимфоцитов, в настоящее время, проводиться с помощью моноклональных антител (мАТ) к СD-антигенам в реакции иммунной флуоресценции с учетом результатов на люминисцентном микроскопе или проточном цитометре. Метод проточной цитометрии является высокоточным и эффективным для анализа популяций и субпопуляций любых лейкоцитов, в том числе по двум и трем маркерам с помощью мАТ меченых флюоресцентными метками, однако не может широко использоваться в клинической практике из-за дороговизны анализов. Для анализа популяций и субпопуляций лимфоцитов помимо методов иммунофлюоресценции с суспензией лимфоцитов можно использовать разработанные нами стабильные иммунодиагностикумы на основе моноклональных антител, позволяющие фенотипировать лимфоциты в лейкосуспензии с регистрацией при обычной световой микроскопии.

1) Общее количество лимфоцитов при подсчете формулы крови. При рождении их содержание 20–28%. На 5–6 день жизни — 40–45%. В возрасте 2–3 мес. их относительное содержание достигает 55–65% и сохраняется на этом уровне до 5–6 лет, после чего происходит их снижение и в возрасте 6–15 лет и у взрослых, относи- тельное количество лимфоцитов составляет 22–30% от других лейкоцитов (около 1500– 2500 клеток в 1 мм3 ). Увеличение количества лимфоцитов (лимфоцитоз) характерно для ряда инфекционных заболеваний, а также рецидивирующих и хронических заболеваний ЛОР- органов и бронхолегочной системы.

2) Общие Т-лимфоциты (CD2+, CD3+- клетки), в настоящее время, определяются с помощью моноклональных антител к СD-антигенам (СD2, СD3). У новорожденных их содержание 40–48%. В раннем детском возрасте — 50–60%. У взрослых их уровень составляет 55–70% (1000–1500 клеток в 1 мм3 ). При заболеваниях инфекционной этиологии характерно снижение CD3+- Т-лимфоцитов до 40–50%, которое может сохранятся в периоде реконвалесценции и не требует иммунокорригирующей терапии. Если же CD3+- Т- лимфоцитов в крови ниже 40% или после бо- лезни их содержание в течении 1 месяца не приходит в норму — это расценивается как Т-клеточный иммунодефицит и необходимо проведение иммунокоррекции или иммунотерапии под контролем иммунограммы.

3) Уровень Т-хелперов и Т-цитотоксических определяется с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тц) антигенам. В норме CD4+ -Т-хелперов 36–45%, CD8+-Т-цитотоксических (супрессоров)-19– 28%, соотношение Тx/Тц (иммунорегуляторный индекс, ИРИ) = 1,5–1.8. При рецидивирующих инфекционных заболеваниях этот индекс снижается до 1,2–1,5, за счет содержания CD4+-Т-хелперов (26–32%). При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2.0.

4) Для выявления ранней фазы  активации лимфоцитов определяют  рецептор для ИЛ-2 (CD25), поздней  — HLA-DR антигены и CD71 (рецептор для  трансферрина). В норме содержание CD25+- лимфоцитов 6–12%. При вирусных и бактериальных инфекциях их уровень может достигать 20–30% в остром периоде заболевания, преимущественно за счет Т-лимфоцитов. Длительное сохранение высокого уровня CD25+- лимфоцитов в ремиссию, после исчезно- вения клинических симптомов, указывающее на гиперактивацию, характерно для рецидивирующих и хронических заболеваний. HLA-DR антиген в норме экспрессируют В-лимфоциты и моноциты (12–18%). При активации он появляется на Т-лимфоцитах (3–6%).

5) Функциональные показатели Т-лимфоци- тов: пролиферативная активность  — реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с определением продукции ИЛ-2, других цитокинов. Способность к бласттрансформации, после стимуляции антигеном или митогеном (ФГА) отражает функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Лучшим показателем активации Т-клеток в тестах in vitro является определение ИЛ-2, который выделяется активированными Т-лимфоцитами и в норме поддерживает пролонгированную пролиферацию. Реакцию подавления миг- рации лимфоцитов (РПМЛ) можно использовать для дифференциальной диагностики с хроническими заболеваниями, при которых появляются медиаторы ПЧЗТ, подавляющие миграцию лейкоцитов.

6) Общее количество В-лимфоцитов  можно определить с помощью  моноклональных антител к антигенам СD19 — СD22, СD72. Используют также антитела к иммуноглобулинам, которые находятся на поверхности В-лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 20–30% всех лимфоцитов (600–800 клеток в 1 мм3 крови). Содержание CD22+-субпопуляции В-клеток составляет 14–20% у здоровых. Есть данные, что при острых респираторных заболеваниях их уровень в фазе реконвалесценции увеличивается до 26–28%.

7) Функциональные продукты В-лимфоцитов — иммуноглобулины классов G, М, A и их субклассы в сыворотке крови и различных биологических жидкостях определяют с помощью реакции преципитации по Манчини, а также иммуноферментным, нефелометрическим и турбидиметрическим методами. При иммунодефицитах уровень иммуноглобулинов снижается, а при стимуляции системы иммунитета и воспалении — повышается. Содержание иммуноглобулинов в норме представлено в табл.1.

 При рецидивирующих инфекционных  заболеваниях имеет важное значение  определение субклассов IgG. Их физиологическое соотношение: IgG1 — 60–66%, IgG2 — 20–30%, IgG3 — 5– 8%, IgG4 — 4–5% от общего иммуноглобулина G (табл. 2). Широкий ряд респираторной патологии, включающей рецидивирующие бронхи- ты, пневмонии, бронхоэктазы, синуситы и др., ассоциируется с наличием дефицита IgG1. Дефицит IgG3 , который может протекать совместно с дефицитом IgG1 , связывают с рецидивирующими обструктивными заболеваниями легких. Рецидивирующие респираторные инфекции бактериальной этиологии (гемофильная палочка, пневмококк) имеют связь с дефицитом IgG2 в ассоциации с дефицитом IgA.

 

2. Принципы иммунофенотипирования лимфоцитов

 Характеристика клеток СИ  по их фенотипу служит одним из основных подходов для изучения их роли в норме и патологии. Оптимальным является его оценка в совокупности с клеточными функциями, т.е. «фенотип+функция».

Фенотип клетки — совокупность молекул, рецепторов, других структурных компонентов, которые она экспрессирует в момент исследования. Этот фенотип определяется активностью соответствующих структурных и регуляторных генов. Поэтому фенотип отражает генную активность клетки, которая, изменяясь под влиянием тех или других факторов, приводит к его модуляции.

Для характеристики фенотипа клеток используются различные маркеры:

- рецепторы, связывающие эритроциты, бактерии, вирусы, иммуноглобулины, гормоны и т.д.

- антигены системы HLA

- молекулы кластера дифференцировки — CD

С целью фенотипирования лимфоцитов широко использовалось определение рецеп- торов к эритроцитам барана и мыши. Гликопротеиды эритроцитов барана (ЭБ) связываются с Т-лимфоцитами, причем ре- цептором для этого служит молекула адгезии CD2. Первые данные об изменении уровня Т- лимфоцитов при многих иммунодефицитных болезнях были получены методом розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК). Позже эти данные были подтверждены путем определения Т-лимфоцитов с помощью моноклональных антител к CD3-молекуле. Хотя метод Е-РОК считается устаревшим, в принципе он позволяет достоверно судить об уров- не зрелых Т-лимфоцитов, хотя и не выявляет Т-клетки с низкоаффинными рецепторами к ЭБ. Однако модификация метода путем обработки ЭБ папаином или нейроаминидазой, «разрыхляющими» мембраны эритроцитов и расщепляющими некоторые вещества, позволяет выявлять всю популяцию Т-клеток, сопоставимую с определением методом проточной цитометрии.