Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности

Использование определения «активных» Т-лимфоцитов, связывающих ЭБ при 37°С, принесло меньше информации из-за неясности сущности феномена и его связи с конк- ретными, ныне известными, субпопуляциями Т-клеток. Все же этот метод в определенной степени детектирует гетерогенность феноти- па Т-клеток и иногда указывает на связь с тяжестью патологического процесса при снижении их уровня.

Применение метода «теофиллинчувствительности» для характеристики Тх и Тс оказалось неприемлемым, так как нет корреляции его показателей с CD4+ и CD8+-лимфоцитами и поэтому значение уменьшения розеткообразования под влиянием теофиллина остается неясным.

1.2.1. Особенности иммунофенотипирования  лимфоцитов методами лазерной проточной цитометрии

Цитометрия клеток в потоке позволяет анализировать их фенотип по морфологическим и молекулярным параметрам. Эти параметры различаются у лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Скорость анализируемого потока 10–30 тыс. клеток в секунду.

Проточный цитометр имеет три основные блока: оптический для измерения рассеивания света и флюоресценции возбуждаемого одним или двумя лазерами; блок преобразования световых сигналов в электрические; компьютер для анализа данных.

Проточный цитофлуориметр FACS Calibur™ производства фирмы Becton Dickinson — универсальная система, предназначенная как для клинических, так и научных исследований, основанных на анализе свойств клеток. Прибор может проводить регистрацию до 6 оптических параметров клеток, включая 4 параметра флуоресценции с использованием двухлазерной оптической схемы, что позволяет оценивать распределение нескольких клеточных маркеров в одной пробе и предоставляет широкие возможности для выбора различных флуоресцентных реагентов и их сочетаний при проведении исследований.

Двухлазерная конфигурация оптической системы прибора гарантирует надежное разделение сигнала при работе с многоцветными метками и позволяет использовать широкий спектр флуоресцентых меток.

Для метода меченых антител применяют флуоресцентные красители — флюоресцеин-5- изотиоцианат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Под воздействием аргонового лазера с длиной волны 488 нм ФИТЦ излучает свет в зеленом спектре, а ФЭ — в оранжево-красном. Применение других флюорохромов и нескольких лазеров позволяет проводить мультицветовой анализ нескольких параметров клетки одномоментно, что является большим преимуществом этой технологии.

Несмотря на то, что иммунофенотипические маркеры лимфоцитов интенсивно изучаются, о чем свидетельствует большое количество работ, их значение при многих нозологических формах остается недостаточно исследованным. Кроме того, для проведения адекватной терапии, необходимо точно знать диагностические иммунологические критерии при назначении тех или иных иммуномодулирующих препаратов.

Наиболее существенным фактором, определяющим состояние иммунитета, является количественная и/или функциональная характеристика субпопуляций клеток системы иммунитета.

К настоящему времени практически сформировался стандарт, по которому осуществляется идентификация иммунокомпетентных клеток и определение их функциональной способности. Он включает:

- выделение лейкоцитарной фракции  крови с лизисом эритроцитов;

- инкубация выделенных клеток с моноклональными антителами к CD-рецепторам — маркерам клеточных популяций при неадекватной для иммунологических реакций температуре — 4°С, из-за «сбрасывания» рецепторов при 37°С;

- обработку клеток моно- или поликлональным антимышиным антииммуноглобулиновым конъюгатом, связанным с флюорохромом;

- идентификацию маркер-несущей субпопуляции при помощи метода проточной цитометрии или иммунофлюоресции.

Данный подход получил широкое распространение в странах Западной Европы, США и России.

Основные недостатки такого подхода — необходимость инкубации при неадекватной температуре 4°С, использование для оценки результатов дорогостоящего проточного цитометра или люминисцентного микроскопа.

При использовании «одинарной» метки выделенные из крови лейкоциты инкубируют с немечеными мАТ против соответствующего CD- антигена при 4°С 30 мин. Когда используют непрямой метод и первичные немеченые мАТ, то на втором этапе добавляют антитела, меченые флуорохромом — антимышиные, козьи или кроличьи иммуноглобулины или их F(ab)2 фрагменты и снова инкубируют при 4°С 30 мин. Очевидно, что хотя «холодовая» инкубация предотвращает движение мембраны и сброс рецептора с антителом, однако не является оптимальной температурой взаимодействия антитела и антигена.

Другим критическим моментом является последующий этап лизиса эритроцитов. Лизирующий раствор (0,8% раствор хлористого аммония + 0,1% NaHCO3 + 0,0037% натрие- вая соль ЭДТА, рН=7,2–7,4), в котором инкубируют клетки 1–3 мин, а затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, может повреждать мембраны лимфоцитов, удаляя с них наиболее лабильные рецепторы активации как непосредственно, так и под действием ферментов, выделяющихся из поврежденных клеток. Когда используют метод с «двойной» меткой, то лейкоциты инкубируют с антителами при 20–22°С 30 мин, что лучше для взаимодействия антител и антигенов. Однако и в этом методе остается этап лизиса эритроцитов. Оптимальным было бы исключить данную процедуру.

Стоимость проточного цитометра составляет (в зависимости от фирмы-изготовителя) от 100 до 230 тыс. долларов США. Кроме того, в странах СНГ, серийно данные приборы вообще не производятся. Естественно, их использование необходимо, особенно для научных целей: для одномоментного выявления двух-трех и более маркеров. Однако при повседневной оценке иммунного статуса больных необходимы более простые и дешевые методы.

Это важно для иммунологического мониторинга населения, и особенно — отдельных его контингентов (ликвидаторов аварии на ЧАЭС, детей, лиц с первичными и вторичны- ми иммунодефицитами, аллергическими заболеваниями).

1.2.2. Фенотипирование лимфоцитов  с частицами, покрытыми моноклональными антителами

Детекция структур клеточной поверхности с помощью свободных антител или других лиганд, связывающихся с определенными подвижными молекулами, которые могут по ней мигрировать и сбрасываться, не отражает той ситуации, когда происходит взаимодействие клетки с рецептором другой клетки, т.е. путем межклеточных контактов, а «лиганд-рецептор» фиксируется на клетке. Поэтому необходим аналитический метод, регистрирующий взаимодействие фиксированных лиганд-антител или антигенов с клеточной поверхностью, моделирующий межклеточные взаимодействия. Такой метод предложен нами на основе диагностикумов с фиксированными эритроцитами — частицами, покрытыми мАТ.

Для анализа фенотипа популяций и субпопуляций лимфоцитов мы предложили ис- пользовать разработанные нами стабильные иммунодиагностикумы на основе моноклональных антител, связанные с частицами. Эритроциты обрабатывали антителами против иммуноглобулинов мыши и сорбировали на них мАТ. В итоге получили стабильный диагностикум, который использовали в прямой реакции розеткообразования с суспензией неочищенных лейкоцитов или лимфоцитов. Сравнение метода с проточной цитометрией и иммунофлюоресценцией позволило установить прямую корреляцию по CD-антигенам, выявляемым разными методами. Однако, количественно метод анти-CD-частиц выявлял меньшее количество CD3+-лимфоцитов и большее CD25+ активированных лимфоцитов, чем метод проточной цитометрии. Это связано, по-нашему мнению, в первом случае с плотностью распределения CD3-молекул на мембране лимфоцитов, так как для образования стабильной розетки в методе анти-CD-частиц требуется большая плотность CD3-молекул, а в проточной цитометрии типируются лимфоциты и с меньшей плотностью распределения CD3-молекул. Выявление же более высокого процента CD25+ лимфоцитов, методом СД-частиц, по-видимому, связано со стабилизацией мембраны при связи нескольких молекул CD25-антигена с антителами прочно сорбированными на частице, т.е. при так называемом «комплексном многоточечном» связывании, что предотвращает их движение к полюсу клетки и сброс рецептора вместе с антителом к нему что происходит при «одноточечном» связывании свободных антител (метод проточной цитометрии).

Мы установили, что при иммунодефицитных вариантах бронхолегочных и инфекци- онно-воспалительных заболеваний, как правило, снижены уровни лимфоцитов с феноти- пом CD3+ Т-общие и CD4+ Т-хелперы, иммунорегуляторный индекс — CD4/CD8. Одно- временно отмечалось усиление экспрессии рецепторов активации — CD25, CD71. Аналогичные данные в целом получены и методом проточной цитометрии.

1.2.3. Иммунофенотипирование  лимфоцитов иммуноферментным методом

 Принцип метода. При применении реагентов фирмы Dako используется сродство стрептавидина к биотину. Фиксированные мазки крови обрабатывают мАТ к к соответствующему CD-антигену, а несвязывающиеся антитела удаляют промыванием. На следующем этапе мазки обрабатывают антителами к мАТ (против мышиного иммуноглобулина) меченные биотином. После чего добавляют стрептавидин, меченый ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой). Выявляют активность фермента субстратхромогенной смесью. При микроскопии вокруг клеток, связавших антитела, имеется ореол окрашенного хромогена. Контроли включают отрицательный образец необработанный мАТ и положительный — клетки с известным фенотипом. В качестве положительного контроля применяют антитела к CD45 (положительны все лимфоциты), а в качестве отрицательного — неиммунный мышиный IgG1 вместо мАТ. Метод не нашел широкого применения. Использование фиксированных мазков с клетками не является оптимальным, т.к. клетки могут терять некоторые молекулы при фиксации.

1.2.4. Иммуномагнитное выделение лимфоцитов как метод их фенотипирования

 Согласно рекламному проспекту  Фирма Dynal (Норвегия) предлагает метод  иммунофенотипирования лимфоцитов на основе их биомагнитного сепарирования и подсчета абсолютного количества. Принцип метода заключается в том, что парамагнитные полистерольные микрочастицы (диаметр 4,5 мкм), конъюгированные с моноклональными антителами к CD4 и CD8 антигенам, связываются с клетками, имеющими эти антигены и после 10 мин инкубации осаждаются на магнитном сепараторе, а несвязавшиеся — удаляются. В итоге подсчитывается количество клеток, связавшихся с микрочастицами.

Это один из методов, в котором мАТ связаны с достаточно крупными микрочастица- ми, которые взаимодействуют с клетками. Способ конъюгации антител с частицами не описывается. Этапы выделения CD4+, CD8+- лимфоцитов:

- цельную кровь разбавляют фосфатным  бу- фером (125 мл крови + 350 мкл буфера)

- удаляют моноциты, для чего к крови добавляют 25 мкл анти-CD14 частиц (Dynabeads), инкубируют 10 мин при магнитном сепараторе, а затем отсасывают надосадочную жидкость (НЖ) с лимфоцитами

- к двум разным порциям НЖ  без моноцитов добавляют по 25 мкл анти-CD4 и на магнитном сепараторе Dynal MPC лимфоциты, связавшие осажденные клетки, ресуспензируют в лизирующем растворе уксусной кис- лоты для разрушения эритроцитов (5 мкм при комнатной температуре)

- добавляют красители (генцианвиолет или акридиновый оранжевый) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева на световом или флуоресцентном микроскопе. Корреляция с проточной цитометрией — 90%.

Данный метод наиболее близок разработанному нами методу CD-частиц, так как микрочастицы несут антитела. Стоимость дозы магнитных частиц для одного анализа составляет 3 долл. Метод ограничен анализом CD8+ и CD4+-лимфоцитов.

1.2.5. Лимфоцитотоксический тест

 Принцип метода. При связывании  антител с антигенами на поверхности  клетки образуется иммунный комплекс, который активирует комплемент, лизирующий клетку. Лизис оценивается по окраске клеток трипановым синим. В методе используются только те изотипы мАТ, которые способны после связывания с антигеном активировать добавленный комп- лемент. Рассчитывается процент окрышен- ных погибших клеток, который отражает количество Т- или В-лимфоцитов соответствующей субпопуляции. В настоящее время метод чаще применяется для выявления HLA- антигенов.

1.2.6. Характеристика связывания  липополисахаридов бактерий лейкоцитами  для оценки иммунного статуса

 В норме клетки СИ постоянно контактируют с бактериями в миндалинах, пейеровых бляшках, других структурах мукозоассоции- рованной лимфоидной ткани. Важнейшими структурами бактериальной стенки и активаторами СИ служат липополисахариды (ЛПС). Центральная часть ЛПС (ядро) — олигосахаридный «кор» состоит из остатков 2-кето-3- дезоксиоктоната, галактозы, глюкозы, гептозы и N-ацетилглюкозамина. С одной стороны, к этому ядру присоединен липид А, а с другой стороны — О-специфические полисахаридные цепочки из 3–4 сахаров, которые являются наиболее иммуногенными в ЛПС и определяют его специфичность.

В целом ЛПС является эндотоксином и уже в небольших дозах вызывает лихорадку из-за активации макрофагов и выделения ими ИЛ1, ФНОa и других цитокинов, поликлональную тимуснезависимую активацию В-лимфоцитов и синтез антител, дегрануляцию гранулоцитов, агрегацию тромбоцитов. Он может связываться с любыми клетками организма, но особенно с макрофагами. В больших дозах угнетает фагоцитоз, вызывает токсикоз, нарушение функции сердечно-сосудистой системы, тромбозы, эндотоксиновый шок. ЛПС некоторых бактерий входит в состав иммуностимуляторов (продигиозан, пирогенал).

В сыворотке крови имеется ЛПС-связывающий белок; ЛПС комплексируется с ним, а затем связывается с CD14-рецептором моноцитов макрофагов и активирует их. CD14 имеется также на В-лимфоцитах и, видимо, на всех лейкоцитах. Суперактивация лейкоцитов через этот рецептор приводит к развитию эндотоксинового шока. Блокировка этого рецептора используется в лечении. ЛПС-активированная сыворотка (комплекс ЛПС+белок) индуцирует экспрессию функционального активного рецептора для ИЛ-8 на нейтрофилах и усиливает их миграцию.

ЛПС и пептидогликан бактерий имеют связующие рецепторы на всех лейкоцитах. Лейкоциты новорожденных слабее связывают ЛПС, чем взрослых. Причем не только через CD14 рецептор, так как имеются другие структуры. В прямом связывании ЛПС участвуют Toll-рецепторы [TLR-1–11].

ЛПС является митогеном для В-лимфоци- тов и может служить суперантигеном. Более того, оказалось, что он может стимулировать пролиферацию отдельных Т-лимфоцитов (1:1000) продукцию ими цитокинов. При местном контакте со слизистой оболочкой носа ЛПС в дозах 0,001–1 мкг/мл через 24 часа активировал CD3 Т-клетки и секрецию цитокинов и ферментов, т.е. индуцировал местное воспаление.