Шпаргалка по "Вирусологии"

29. ПРИНЦИП ЗАРАЖЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ВИРУССОДЕРЖАЩИМ МАТЕРИАЛОМ. ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК».

Для заражения отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные АТ и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют на 1-2 часа при 22-37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Вируссодержащий материал удаляют из емкостей и наливают поддерживающую среду. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию; по положительной реакции гемадсорбции; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе.

Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства.

30. ЦИТОПАТИЧЕСКОЕ  ДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ И ЕГ ФОРМЫ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло - или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

Внутриклеточные включения, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток.

На уровне клетки выделяют автономные инфекции, если вирусный геном реплицируется независимо от клеточного, и интегрированные инфекции, если вирусный геном включается в состав клеточного. Автономная инфекция делится на продуктивную, при которой образуется инфекционное потомство вирионов, и абортивную, при которой инфекционный процесс обрывается, и новые вирусные частицы не образуются совсем или образуются в небольшом количестве. Продуктивная и абортивная инфекции могут быть острыми ихроническими. Острая инфекция в зависимости от исхода подразделяется на цитолитическую и нецитолитическую. Цитолитическая инфекция завершается деструкцией клеток, или ЦПД, а вирус, вызывающий ЦПД, называется цитопатогенным. Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет. Проявление ЦПД в культуре клеток К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают28 культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37 0С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более). ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:

- энтеровирусы вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток;

- аденовирусы превращают  клеточный слой в скопления  мелких, округлых клеток, расположенных  в виде гроздьев винограда;