Шпаргалка по "Вирусологии"

С помощью серологической реакции можно: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства 2 вирусов, определять титр вируснейтрализующих АТ в сыворотке, или индекс нейтрализации, идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками.

Серологические реакции.

1. РИФ – реакция иммунофлюорисценции.

АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.

2. ИФА – иммуно-ферментный анализ.

АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.

3. РСК – реакция связывания  комплемента.

АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.

4. РДП - реакция диффузной преципитиции.

АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.

5. РНГА – реакция непрямой гемаглютинации.

Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.

6. РТГА – реакция торможения  гамаглютинации

7. РТГАд – реакция торможения гемадсорбции

8. РН – реакция нейтрализации.

Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.

15. РТГА И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ.

Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

 

16. РГА И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ

Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

17. Явление гемадсорбции и его практическое значение в вирусологии. Принцип постановки РГАд и РЗГАд.

Гемадсорбция — соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, инфицированных гемагглютинирующим вирусом, адсорбируются эритроциты, чувствительные к нему.

Реакцию гемадсорбции целесообразно ставить с целью обнаружения в инфицированной культуре клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей способностью.

Компонентами реакции служат культура клеток в пробирках в норме и инфицированная, а также 0,4%-ная взвесь эритроцитов, приготовленная на физиологическом растворе или растворе Хенкса.

Методика реакции состоит в следующем. Из пробирок с культурой клеток, инфицированных и неинфицированных (контроль), удаляют питательную среду (можно без удаления) и вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов, способных агтлютинироваться предполагаемым вирусом. Затем штатив с пробирками встряхивают и оставляют в наклонном положении полосой вверх, при комнатной температуре или помещают в холодильник, длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса.

Учет реакции гемадсорбции проводят при малом увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания или вращения пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксируются на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного промывания. На клетках, пораженных вирусом, эритроциты адсорбируются в виде островков или диффузно (островковый и диффузный тип адсорбции). При отрицательной реакции адсорбция эритроцитов на культуре клеток не наступает, и они свободно плавают в поле зрения микроскопа.

РЗГАд— высокоспецифическая серологическая реакция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагглютинирующих вирусов

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток — РЗГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обладают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

18. «Реакция Диффузной Преципитации. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА МЕОДА, ПОСТАНОВКА И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ».

РДП в геле основана на способности к диффузии в гелях АТ и растворимых АГ и отсутствие такой способности у комплекса «АГ+АТ». Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации. В качестве геля используют крахмал, желатин, агар-агар и другое. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель. Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублении и в них наливают АГ и сыворотки так. Чтобы АГ и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок АГ и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими АГ и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс «АГ+АТ», который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает на месте образования в виде беловатой полосы преципитации. РДП решает задачи: 1) обнаружение в сыворотке крови АТ, гомологичных АГ; 2) обнаружение в материале АГ, гомологичного известным АТ сыворотки;3) идентификация неизвестного вируса; 4) титрование АТ сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным АГ, служит показателем титра АТ в сыворотке. РДП часто используют для диагностики лейкоза КРС и инфекционной анемии лошадей.

Для осуществления РДП на предметных стеклах нужны: обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки (2-5 мл), пастеровские пипетки; трубка диаметром 5мм или штамп, влажная камера, инструмент для извлечения из лунок геля, агар, АГ, сыворотки. Постановка РДП: Предметные стекла кладут на холодную поверхность. Из пипетки наливают агар (слой 1,5-2 мм), дают остыть 5-10 минут. Вырезают лунки, запаивают их. В лунки заливают компоненты РДП, помещают во влажную камеру (где оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат). Препарат РДП на предметных стеклах можно через 48-72 часа высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранить препарат неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации.

Плюсы РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми АГ, возможность документирования результата путем фотографирования.

Минусы РДП: низкая чувствительность. Реакцию ставят для обнаружения в патматериале вирусов бешенства, инфекционного ринотрахеита КРС, африканской чумы свиней, чумы собак, других; А также для идентификации вирусов инфекционной анемии лошадей, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, вируса диареи КРС, для обнаружения в сыворотках крови АТ к вирусам инфекционной анемии лошадей, респираторно-синцитиального вируса КРС и во многих других случаях.

 

 

19. Реакция нейтрализации, принцип, техника постановки, использование  в вирусологии.

Эта реакция основана на том, что антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. В основном эту реакцию используют при вирусных заболеваниях как для определения антител в крови больного, так и для идентификации вирусов. Принцип реакции заключается в том, что исследуемые сыворотки смешивают с вирусосодержащим материалом и выдерживают некоторое время. Затем эту смесь вводят чувствительным лабораторным животным. О результатах этой реакции судят по гибели животных. При отсутствии у животных повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов и токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки.

Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10-1, 10-2, 10-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 370С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов. 
      За заражёнными животными (опытными  и контрольными) устанавливают наблюдение  в течение 2-х недель, регистрируют  заболевших и погибших мышей.  Учёт реакции проводят путём  сопоставления количества погибших  опытных и контрольных мышей  

20. ПРИНЦИП РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ, ПЛЮСЫ И МИНУСЫ ЕЕ

В диагностике вирусных болезней ретроспективная дианостика играет очень важную роль. Существуют обстоятельства, при которых практически невозможно выделить вирус, или когда вирус принадлежит к трудноизолируемым из патологического материала ( некоторые тога,- буньявирусы и др.). При проведении ретроспективной дианостики применяют серологические методы. Для этой цели исследуют парные сыворотки крови больных животных, для получения которых от каждого животного кровь для исследования на наличие специфический антител берут дважды с интервалом в 2-3 нед: в начале заболевания ( в острой фазе) и в конце его ( в период выздаровления-реконвалесценции). Чтобы сыворотки были стерильными, берут кровь и получают из нее сыворотку в асептических условиях. До исследования сыворотки в пробирках под пробками хранят в холодильнике или в замороженном состоянии. Парные сыворотки крови обычно берут не менее чем от 10-20 животных и исследуют их одновременно. 
 
Задача исследования сводиться к установлению в парных сыворотках титра антител к вирусам, которые предположительно могли бы быть возбудителями болезней животных, от которых получены сыворотки. Предположение, к каким вирусам следует искать антитела, исходить от предварительного диагноза, поставленного по данным эпизоотологических наблюдей, клинических симптомов и патологоанатомичческих изменений. Наличие в сыворотках антител их титры определяют с серолоических реакциях с использованием эталонных антигенов предполагаемых вирусов. Выбор серологической реакции определяется тем, какая из них наиболее пригодна для работы с вирусом, а также возможностями лаборатории и квалификацией персонала. При этом учитывается быстрота получения ответа, трудоемкость работы и стоимость диагностикумов. 
 
После установления титра антител в парных сыворотках результаты интерпретируют изходя из динамики титра антител. Считается, что нарастание в 4 раза и более титра антител во второй сывортке по сравнению с первой уверенно свидетельствует об активном инфекционном процессе, протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь была вызвана тем возбудителем, к которому было установлено повышения титра антител в парных сыворотках.

+ роль – метод позволяет достоверно поставить диагноз в большинстве случаев.

- роль – длительность ретроспективной диагностики.

 

 

 

 

 

21. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ. ВИДЫ ВАКЦИН И МЕТОДЫ ИХ ВВЕДЕНИЯ

Целью ИммуноПрофилактики являются не только искоренение инфекционных болезней, но и сохранение продуктивности, поэтому необходимо стремиться к созданию таких вакцин, которые способны обеспечить высокую степень защиты всего поголовья сразу после вакцинации, не зависимо от возраста животных.