Группы крови

• Белые фарфоровые или эмалированные тарелки или любые другие пластинки со смачиваемой поверхностью, маркированные 0(1), А(Ы), ВЦП), AB(IV).
• Изотонический раствор хлорида натрия.
• Иглы, пипетки, стеклянные палочки (предметные стекла).

 

      Техника проведения реакции

     Под соответствующими обозначениями группы крови на тарелку (пластинку) наносят  стандартные изогемагглютинирующие  сыворотки I, II, III групп в объеме 0,1 мл (одна большая капля около 1 см в диаметре).

     Во избежание ошибок наносят две серии сывороток каждой из групп, так как одна из серий может иметь низкую активность и не дать четкой агглютинации. Всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: О (I), A (II), В (III).

     Кровь для исследования берут из пальца или из вены. Шесть капель исследуемой  крови величиной приблизительно с булавочную головку 0,01 мл (маленькая  капля) последовательно переносят  сухой стеклянной палочкой на пластину в 6 точек, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой она смешивается), потом их осторожно с помощью стеклянных палочек с закругленными краями перемешивают.

     Возможна более простая методика: на тарелку наносят одну большую каплю крови, из которой ее забирают уголком предметного стекла и переносят в каждую каплю сыворотки, аккуратно перемешивая с последней. При этом всякий раз кровь берут новым уголком стекла, следя за тем, чтобы капли не сливались.

     После смешивания тарелку периодически покачивают. Агглютинация начинается в течение  первых 10-30 секунд, однако наблюдение следует  обязательно вести до 5 минут ввиду  возможности более поздней агглютинации, например с эритроцитами группы А2(Н).

     В те капли, где произошла агглютинация, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результат реакции. 

     Трактовка результатов

     Реакция агглютинации может быть положительной  или отрицательной.

     При положительной реакции обычно в  течение первых 10-30 секунд в смеси  появляются видимые невооруженным  взглядом мелкие красные зернышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие зернышки постепенно сливаются  в более крупные зерна, а иногда в хлопья неправильной формы.

     При этом сыворотка частично или полностью  обесцвечивается. При отрицательной  реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет и в  ней не обнаруживается никаких зернышек (агглютинатов).

     Принадлежность  исследуемой крови к соответствующей группе определяют по наличию или отсутствию агглютинации при реакции с соответствующими сыворотками.

     При этом следует отметить, что, если сыворотки  всех трех групп дали положительную  реакцию, это указывает на то, что  испытуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В и принадлежит к группе AB(IV).

     Однако  в таких случаях для исключения неспецифической реакции агглютинации необходимо провести дополнительное контрольное  исследование испытуемой крови со стандартной  изогемагглютинирующей сывороткой группы AB(IV), не содержащей агглютининов.

     Лишь  отсутствие агглютинации в этой капле  при наличии агглютинации в каплях, содержащих стандартные сыворотки  групп 0(1), А(И) и В(Ш), позволяет считать  реакцию специфической и отнести  исследуемую кровь к группе АВ0 (IV).

     Следует отметить, что при наличии в  исследуемой крови слабого подтипа  антигена А2 реакция агглютинации с  гемагглютинирующими сыворотками  групп 0(1) и В(Ш) начинается позже (на 3-4 минуте).

     Для точного определения подтипа  антигена А необходимо проведение дополнительной реакции с так называемым анти-А, реактивом, изготовляемым из семян растения Dolichos bitforis, содержащим только анти-А, антитела (проводится в серологической лаборатории).

     1.2 Группы крови - перекрестный способ

     Способ наиболее часто используется в серологических лабораториях.

     Суть  метода состоит в определении  наличия или отсутствия в исследуемой  крови групповых антигенов А  и В с помощью стандартных  изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител  а и Р с помощью стандартных эритроцитов. Это дает полную серологическую характеристику крови.

     Реакция со стандартными эритроцитами проводится следующим образом.

     Необходимое оснащение:

     Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для реакции агглютинации необходимы стандартные эритроциты трех групп крови: 0(1), А(П), В(Ш).

     Стандартные эритроциты приготавливают из крови  доноров с заранее известной  группой крови, хранят при 4-8°С. Срок годности 2-3 дня.

     Техника проведения реакции:

     1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 минут для разделения на сыворотку и эритроциты.

     2. На маркированную тарелку пипеткой  в шесть ячеек наносят по  одной большой капле сыворотки  исследуемой крови из пробирки (0,1мл), а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп 0(1), А(П), В(Ш) (по две серии).

     3. Дальнейшие мероприятия проводятся  аналогично методу с использованием  стандартных изогемагглютинирующих  сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.  

     Трактовка результатов

     При трактовке результатов оценивают данные, полученные при обеих реакциях со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами.

     Особенностью  трактовки результатов реакции  со стандартными эритроцитами является то, что эритроциты группы 0(1) являются контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

     Результат перекрестного способа считается  достоверным только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать. 

     1.3 Определение групп крови моноклональными антителами

     Необходимое оснащение:

     Для определения группы крови используются моноклональные антитела, для получения которых применяется гибридомная биотехнология.

     Гибридома - это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки опухоли  костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические  моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих "родителей": способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

     Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела (МКА): цоликлоны анти-А и анти-В, которые применяют для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны представляют из себя ли-офилизированный порошок красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, который разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием.  

     Техника проведения реакции:

     Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый  планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А или анти-В. Рядом с каплями  антител наносят по одной маленькой капле (0,01мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.  

     Трактовка результатов

     Оценка  результатов очень проста.

     Методика  определения группы крови с помощью  цоликлонов позволяет отказаться от услуг доноров, кровь которых используют для приготовления стандартных изогемагглютинирующих сывороток.

     Возможные ошибки.

     Определение групповой принадлежности с помощью  реакции агглютинации может сопровождаться ошибками, которые ведут к неверной трактовке результатов. Все ошибки можно разделить на три группы:

• низкое качество реагентов,
• технические ошибки,
• особенности исследуемой крови.

     Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки  и стандартные эритроциты могут  иметь низкие агглютинабельные свойства, что приводит к неверному толкованию результатов реакции. Во избежание подобных ошибок следует следить за сроком годности реагента, условиями хранениями, а также их внешним видом (прозрачность сыворотки, отсутствие пленок, хлопьев, запаха гниения и пр.). 

     1.4 Технические ошибки

     Ошибки  технического характера связаны  с несоблюдением или недостаточно точным выполнением всех правил проведения реакции.

     Несоблюдение  внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды)

     Плохая  освещенность мешает обнаружить агглютинацию или ее отсутствие.

     Повышение температуры свыше 25°С резко замедляет  агглютинацию.

     При низкой температуре (менее 15°С) может  произойти неспецифическая агглютинация независимо от состава агглютининов и агглютиногенов, так называемая холодовая панагглютинация (агглютинация отмечается при реакциях с сыворотками всех групп крови). Это явление происходит за счет наличия в сыворотке особого холодового агглютинина, который может давать реакцию агглютинации только при низких температурах.

     Неправильное  проведения самой реакции.

     Нарушение расположения сывороток, соотношения  сыворотки и крови, слияние соседних капель и пр. создают возможность  неправильной интерпретации полученных результатов.

     Ранняя  оценка результатов также может привести к ошибке, особенно при наличии подтипа антигена А (слабого антигена А2), дающего позднюю агглютинацию.

     Недобавление  физиологического раствора.

     Несоблюдение  этого простого правила (в капли, где произошла агглютинация, следует  добавить изотонический раствор хлорида натрия) может привести к тому, что за специфическую агглютинацию будет принята ложная (псевдоагглютинация).

     Под термином псевдоагглютииация подразумевают  способность эритроцитов склеиваться  в монетные столбики или кучки  с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств.

     Границы между форменными элементами хорошо видны под микроскопом, в отличие  от истинной агглютинации, при которой  происходит разрушение мембран эритроцитов. Добавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия позволяет дифференцировать истинную агглютинацию от ложной. Псевдоагглютинация расходится довольно быстро, в то время как истинная агглютинация сохраняется прежней или становится более выраженной. 

     2. Понятие о резус-факторе 

     2.1 Определение резус-фактора 

     В 1940 г. К. Ландштейнер и А. С. Винер  обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный  ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а 15% лиц  этого фактора не содержат.

     Система антигенов резус-фактора представлена 6 основными антигенами. Образование резус-антигенов контролируется тремя парами ал-лельных генов: Dd, Cc, Ее, которые расположены на двух хромосомах. Каждая из хромосом способна нести только 3 гена из 6, причем лишь 1 ген из каждой пары - D или d, С или с, Е или е. Гены Dnd, Сие, Еие являются по отношению к друг другу аллельными. В последнее время было доказано, что аллельного гена d не существует.