Генная инженерия

   Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции.

   Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть секвенирование, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы сек-венирования.

   Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов in vitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически. Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн- и Саузерн-блоттинги. 

4.3. Генетические векторы

   Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами. Последние должны обладать, как минимум, двумя свойствами. Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях. Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т. е. обладать маркером, на который можно вести контрселекцию клеток, содержащих вектор вместе с клонируемым геном (рекомбинантные молекулы ДНК). Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги. Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.

   Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Например, плазмидный вектор pBR 322, который содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов-рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco R I, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I

   Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате ин-фицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага лямбда.

    Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК.

   Если клонирование генов проводят, используя клетки млекопитающих или растений, то требования к векторам те же, что и в случае клонирования в бактериальных клетках.

4.4. Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

    Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

   Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу Легирование(связывание) будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате самокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие рестриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс легирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).

    Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен Поли-А-хвост, на другом -- Поли-т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15--20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

4.5. Введение рекомбинантных молекул ДНК в клетки

     После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные рекомбинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомбинантной ДНК.

    Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

     Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клонированием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I --плавление на этом сайте генерирует липкие концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры без включения в них клонируемых сегментов. Чтобы уменьшить частоту спонтанного образования таких кольцевых молекул векторной ДНК, рестрикты векторной ДНК обрабатывают фосфатазой. В результате этого образование кольцевых молекул ДНК становится невозможным, поскольку будут отсутствовать концы 5'-РО^, необходимые для действия лигазы.

    Совокупность колоций-трансформантов, выросших на селективной среде, представляет собой совокупность клеток, содержащих клоны разных фрагментов (генов) клонируемой геномной или кДНК. Коллекции этих клонов формируют так называемые библиотеки ДНК, широко используемые в генно-инженерных работах.

   Заключительной стадией клонирования генов является выделение и исследование клонированной ДНК, включая секвенирование.

   Перспективные штаммы бактерий или соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, которые контролируют синтез интересующих белков, имеющих коммерческую ценность, передают в промышленность. 

   Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора.

Одним из перспективных  методов клеточной  инженерии в культуре клеток человека, животного  и растения является гибридизация соматических клеток (Б. Эфрусси и Г. Барски).

        В культивируемые клетки млекопитающих или развивающиеся эмбрионы ДНК вводят методом микроинъекции ДНК в ядро с помощью микроманипулятора.

       Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать организм, идентичный тому, чье ядро было перенесено в яйцеклетку.

     Создание гибридов высших растений возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток.

     Все эти методы могут использоваться для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений, несущих гены, детерминирующие желаемые признаки.

     Не менее важна генная инженерия как аппарат фундаментальных исследований.

Потенциальные возможности генной инженерии в  действительности очень велики, и  они будут реализовываться.

5. Среда и наследственность

     Излечивая больного, предотвращая распространение инфекционных заболеваний, врач использует могучее влияние среды на живой организм. Лечить - это значит так изменить среду, чтобы эти изменения шли на пользу больному, помогая ему бороться с болезнью. В борьбе с инфекциями наука достигла поразительных результатов. Лечение наследственных или врожденных заболеваний - дело гораздо более трудное. В случае врожденной болезни инфицирующий возбудитель отсутствует. Нет врага, которого следует уничтожить. Излечимы ли наследственные болезни, возможна ли их профилактика? Неужели действительно нет способов воздействовать извне на наследственный недуг, снять с помощью лекарства, диеты, лечебной гимнастики, хирургическим путем, наконец, симптомы заболевания?

Благодаря достижениям медицинской цитологии  и биологической химии ученые начали понимать, в чем же заключается разница между здоровым организмом и организмом, отягощенным наследственной болезнью. Разработаны способы ранней диагностики многих наследственных заболеваний и найдены методы их лечения. По отношению к некоторым болезням открылась возможность предупредить рождение больных детей или предотвратить у них развитие болезни. Успех таился на стыке наук. Стена, отделяющая ученых-биологов и врачей-практиков, рухнула. Этот процесс осуществляется одновременно во всем мире. Интерес к законам наследственности со стороны врачей значительно возрос.

Наследственно обусловленные болезни человека привлекают к себе в настоящее  время огромное внимание ученых всех стран. Создаются специальные научные  институты для их изучения, периодически созываются

Съезды по медицинской генетике, издаются специальные журналы. Эта новая глава медицины развивается быстрым темпом. Современному человечеству удалось в какой-то мере справиться с рядом болезней, таких, как многие инфекции (туберкулез, оспа, тифы, сифилис, малярия и др.).  Или как многие хирургические заболевания, вследствие чего значительно увеличилась средняя продолжительность жизни современных людей; в то же время в отношении наследственных болезней до последнего времени почти ничего еще не было сделано. Понятен тот огромный интерес, который в настоящее время привлекают к себе эти заболевания.

   Важная роль при этом принадлежит тщательному изучению семейного анамнеза, составлению и анализу родословной. Успехи в ранней диагностике наследственных заболеваний обмена веществ в период, когда имеются лишь небольшие нарушения и заболевание еще не привело к необратимым морфологическим изменениям, способствуют разработке мер лечебного воздействия. Занятия физической культурой благотворно влияют на человека, и людям, занятым умственным трудом, необходимо компенсировать ограничение двигательной активности. Но вернемся к тесту. Длительный сон (свыше 10 часов в сутки) отрицательно влияет на продолжительность жизни, сокращая ее на 4 года по сравнению с 7-8-часовым сном, что также объясняется снижением двигательной активности, а значит, и ухудшением кровообращения. Тест показал, что агрессивные люди вспышками гнева укорачивают свой век, тогда как спокойные - продляют его благодаря собственной уравновешенности. Разница в продолжительности жизни этих двух категорий лиц составляет шесть лет. На продолжительность жизни отрицательно влияют курение, употребление спиртного, наркотиков, избыточный вес, положительно влияет образование. Среднее удлиняет ее на год, а высшее - на два. Образование развивает интеллект и культуру, которые влияют на всю организацию жизни человека.