Генная инженерия

     Введение 

     В своей работе я раскрываю тему генной инженерии. Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством, как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны.

     Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические  процессы для получения продуктов  ферментации - энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека.

     Таким образом, генная инженерия, будучи одними из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

     Но  особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии может привести к коренным преобразованиям медицины.

     Многие  болезни, для которых в настоящее  время не существует адекватных методов  диагностики и лечения (раковые, сердечнососудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные и умственные расстройства), с помощью генной инженерии и  биотехнологии станут доступны и  диагностике, и лечению. 
 
 
 
 
 
 

     

1. Сущность  генетической инженерии.

 
     

1. История генной инженерии.

     Генная  инженерия появилась благодаря  работам многих исследователей в  разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.

     На  протяжении многих лет главным классом  макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют  белковую природу.

     Лишь  в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.

     С этого времени начинается интенсивное  изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и  Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать  годом рождения молекулярной биологии.

     На  рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к  концу 60-х годов его универсальность  была подтверждена экспериментально.

     Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали  кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.

     Были  разработаны методы выделения высокоочищенных  препаратов неповрежденных молекул  ДНК, плазмид и вирусов.

     ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов.

     В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения  ДНК. Особая роль в развитии методов  генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

     Историю развития генетической инженерии можно  условно разделить на три этапа:

     Первый  этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

     Второй  этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул  ДНК между хромосомными генами прокариот  и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

     Третий  этап - начало работ по включению  в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные  встраиваться в генетический аппарат  клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

     Формально датой рождения генетической инженерии  следует считать 1972 год, когда в  Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli. 

     

2. Понятие о генной инженерии

     Одним из разделов молекулярной генетики и  молекулярной биологии, который нашел  наибольшее практическое приложение, является генная инженерия.

     Генная  инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это  технология направленного конструирования  новых биологических объектов.

     Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих  в «фабрики» для масштабного  производства любого белка.

     Это дает возможность детально анализировать  структуру и функции белков и  использовать их в качестве лекарственных  средств.

     В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.

     Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной  железы животных, поэтому стоимость  его была очень высока. Для получения 100г кристаллического инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это  делало инсулин дорогим и труднодоступным  для широкого круга диабетиков.

     Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.

     Было  показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.

     Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.

     Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.

     Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.  

     

3. Цели  и задачи генной инженерии

     Цель  прикладной генетической инженерии  заключается в конструировании  таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

     На  технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают  экспрессию генов в тканях, локализацию  генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды  также используются в диагностике  различных заболеваний.

     Технология  рекомбинантных ДНК сделала возможным  нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При  таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный  ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

     Если  гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, передающие мутантный ген потомками.

     Генетическая  трансформация животных позволяет  установить роль отдельных генов  и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.

     Технология  рекомбинантных ДНК использует следующие  методы:

• специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
• быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
• конструирование рекомбинантной ДНК;
• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;
• клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

 
 
 
 

 

     

2. Этапы создания организмов с генетически  измененной программой.

 
     

1. Выделение генов, содержащих необходимую  информацию.

     Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

       Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), Превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

     Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одно цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК

     Нужная  последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нукеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.

     Ферментный  синтез гена на основе выделенной матричной  РНК(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присуттвует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в одобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.

     Метод с большим успехом применен для  получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина). Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена. Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.