Приложение  № …

      Описание  некоторых лабораторно-практических работ, используемых при апробации  спецкурса „Белок – основа жизни“.

1. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.

Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических жидкостях.

1. Выделение казеина из молока.

Вариант I.

      В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают  аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок растворяется. Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.

      Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют ещё  на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. К осадку ещё раз добавляют 10 мл дистиллированной воды, осторожно перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют смесь через бумажный фильтр.

      Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор: осадок с фильтром переносят в широкую пробирку с обратным холодильником и добавляют 6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Пробирку нагревают на песчаной бане в течение 1 часа. Жидкости дают остыть и нейтрализуют её концентрированной азотной кислотой до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка.

      После отстаивания жидкость фильтруют  и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию и молибденовую пробу  на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата  добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого раствора CuSO₄. Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят несколько минут. В присутствии H₃PO₄ жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении выпадает жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения (NH₄)₃PO₄·12MoO₃.

      Вариант II.

      К 50-ти мл свежего молока добавляют  равный объём насыщенного раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и казеин. Отфильтровывают  через складчатый бумажный фильтр раствор альбуминов. 

2. Получение раствора яичного альбумина.

      Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок  в стакан вместимостью 500 мл. В тот  же стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое стакана тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

      Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора доводят до 300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор оставляют на 30 минут  при комнатной температуре для  образования хлопьевидного осадка глобулинов, затем разливают в пробирки по 20 мл.

      20 мл полученной суспензии дважды  фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для дальнейшей работы. 

3. Выделение белков мяса.

      Помещают  в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и оставляют смесь стоять 15-20 минут при частом помешивании. Отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр или через двойной слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В растворе содержатся главным образом, мышечный альбумин и глобулин. 

4. Выделение растительных альбуминов.

      25 грамм пшеничной муки смешивают  со 100 мл дистиллированной воды, и  смесь стряхивают в течение  одного часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр. Отфильтрованный прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин пшеничных зёрен. 

2. Реакции осаждения  белков.

      Цель: выявить влияние различных органических и неорганических веществ на осаждение белков. Изучить физические свойства белков. 

1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

 

      В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO₃, H₂SO₄, HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке добавляют из пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так чтобы он не смешивался с кислотой. Вместе соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии HNO₃, увеличивается, а осадки выпавшие при действии HCl и H₂SO₄, растворяются в их избытке.

      Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые  осаждения белков. Это связано  как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка.  

2. Осаждение белков органическими кислотами.

 

      В две пробирки добавляют по 2-3 мл раствора белка и добавляют в одну из них несколько капель 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а  в другую – несколько капель 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается  выпадение осадка белка. Сульфосалициловая и ТХУ кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок.

      ТХУ кислота осаждает только белки и  не осаждает продукты распада белка  и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови).

3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

 

      В две пробирки добавляют по 1-1,5 мл исследуемого пастора белка, по каплям при встряхивании, добавляют в  одну из них раствор CuSO₄, а другую –

Pb(CH₃COO)₂.  Выпадает хлопьевидный осадок вследствие образования малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди – голубого цвета). При избытке реактива осадок снова растворяется.

      Соли  тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Потому что белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например, ртутными солями (сулема). 

3. Гидролиз  белка.

      Цель: дать учащимся представление о кислотном, щелочном и ферментативном гидролизе белка. Опытным путём установить продукты распада белковой молекулы. 

1. Кислотный гидролиз простого белка.

 

      При гидролизе белки распадаются  сначала на высокомолекулярные продукты – пептоны, затем на полипептиды  и, наконец, на аминокислоты.

      Для гидролиза отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной HCl. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой. Кипятят содержимое колбы под тягой в течение 45 или 90 минут.

      Открытие  промежуточных продуктов распада  белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. Промежуточные продукты распада белка – пептоны – при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а белки – сине-фиолетовое. 

2. Ферментативный  гидролиз белка.

 

      Подготовительный  этап: белок куринового яйца развести 1:1 водой и раствор белка влить в кипящую воду (V=100 мл) при помешивании.

      В две пробирки налить по 2 мл приготовленного  раствора белка. В первую добавить 1 мл дистиллированной воды, во вторую – 1 мл 1%-го раствора пепсина. Обе пробирки поставить в водяную баню при t=37-40 ⁰C на 15 минут. Проделать биуретовую реакцию с содержимым обеих пробирок.

      В воде окраска более интенсивная (фиолетовая с синим оттенком), так  как при гидролизе осталось больше пептидных связей, чем в случае с пепсином (окраска менее интенсивная – фиолетовая с розовым оттенком) – меньше пептидных связей.

      В присутствии пепсина гидролиз идёт интенсивнее, чем в присутствии  воды. 

4. Денатурация белков.

Цель: определить факторы, вызывающие денатурацию  белка.

      4.1. В три пробирки наливают по два мл раствора белка куриного яйца, предварительно разведённого 1:20 и профильтрованного через двойной слой марли.

      В первую пробирку наливают насыщенный раствор сульфата аммония; во вторую – концентрированную HNO₃; в третью – этиловый спирт. Белок свёртывается во всех пробирках.

      4.2. В три пробирки добавляют по 2 мл раствора белка. Во вторую  добавляют одну каплю 1%-го раствора  уксусной кислоты; в третью  – одну каплю 10%-го раствора  NaOH. Все три пробирки нагревают над пламенем спиртовки.

      В первой пробирке (pH=7) образуется осадок белка, вследствие его денатурации при нагревании, во второй пробирке осадок образуется быстрее и полнее вследствие нейтрализации белка в слабокислой среде; в третьей пробирке (pH>7) осадка не образуется даже при кипячении.

5. Качественные реакции на белки.

      (Цветные  реакции на белки; определение  аминокислотного состава белков). 

      Цель: Путем качественных реакций определить наличие пептидных связей и NH₂ – групп в молекулах белков; выявить аминокислотный состав белков. 

1. Обнаружение в молекулах белков пептидных связей (биуретовая реакция).

      К 1-2 мл разбавленного белка добавляют  двойной объем 30%-ного раствора NaOH хорошо перемешивают и приливают 2-3 капли 1%-ного раствора CuSO₄. Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание. (Химизм реакции см. на стр.…). 

2. Нингидриновая реакция.

      К 2-3 мл разбавленного раствора белка  приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор  перемешивают и ставят в водяную  баню при t=70 ⁰С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание.

      Нингидриновая реакция доказывает наличие NH₂ – групп в белках (химизм реакции на стр.…). 

3. Ксантопротеиновая реакция (реакция на ароматические  аминокислоты: фенилаланин, тирозин, триктофан).

      В одну пробирку добавляют 5 капель раствора яичного белка, во вторую – раствора желатина, в третью – раствора миозина. Во все пробирки приливают по 3-5 капель концентрированной HNO₃ и нагревают. В первой и третьей пробирках образовался белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется в (происходит гидролиз белка), сообщая желтую окраску раствору. Желатина, не содержащая ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы. Образование желтых пятен на коже при попадании концентрированной HNO₃ обусловлено этой реакцией (химизм реакции на стр.…). 

4. Реакция на тирозин (реакция Миллона).

      Реакция обусловлена наличием в белках аминокислоты тирозина. При нагревании или продолжительном  стоянии раствора белка с реактивом Миллона (раствор нитратов ртути (I) и (II) в HNO₃ с примесью HNO₂) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в кроваво-красный цвет.

      В 4 пробирки наливают по 5 капель: в первую – раствора яичного белка, во вторую – раствора желатина; в третью – раствора миозина; в четвертую – раствора тирозина. Во все 4 пробирки добавляют по 2-3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. Наблюдают происходящие изменения (химизм реакции на стр.…). 

5. Реакция на цистеин (реакция Фоме).

      В первую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, во вторую – 1%-ного раствора желатины, в третью – раствора миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора NaOH и по 1 капли 5%-ного раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в пробирках с яичным белком и миозином темнеет, так как образуется черный осадок сульфида свинца. В пробирке с раствором желатина черного осадка не образуется, так как данное вещество не содержит серосодержащих аминокислот (химизм реакции на стр.…).