Питательные среды для выращивания микроорганизмов

капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку  и добавляют каплю

бульона. В нейтральной  среде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой —

желтый, в щелочной — синий. После установления реакции  среду снова кипятят

5—10 мин и  белки, свернувшиеся от изменения  реакции, отфильтровывают через

бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Прозрачный

Мясо-пептонный  бульон разливают в пробирки, закрывают  ватными пробками и

стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонный  агар (МПА). К 1 л

мясо-пептонного бульона добавляют 15—20 г мелко  нарезанного агар-агара.

Среду нагревают  до растворения агара (температура  плавления его 100°С,

застывания —40°С),устанавливают  слабощелочную реакцию среды 20%-ным

раствором Na2COa и  через воронки разливают в  пробирки (но 10 мл для

разливок в  чашки — агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного,

наклонного агара). При разливе агара необходимо следить затем, чтобы края

пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к  стеклу. Пробирки со средой

стерилизуют в  автоклаве при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонная желатина

(МПЖ). В 1 л  мясопептонного бульона помешают 100—150 г желатины.

Температура плавления  зависит от процентного содержания в среде. 10%-ная

желатина плавится при 24°С, 15%-пая — при 25°. В летнее время среды

готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатины при осторожном

нагревании в  среде устанавливают слабощелочную  реакцию (как и для МПБ и

МПА), кипятят  в течение 5мин, затем охлаждают -до 40—50°С. Одновременно

яичный белок  взбивают с небольшим количеством  воды, вливают его в

охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда

после выпадения  белков становится прозрачной. Ее фильтруют  через горячую

воронку, разливают  в пробирки и стерилизуют в  кипятильнике Коха текучим

паром, прогревая  среду по 30 мин через 24 ч 3 раза. 

Картофельный агар. 200 г очищенного и промытого водой картофеля нарезают

ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют

через вату и  доводят до первоначального объема. К полученной жидкости

прибавляют 2% агара, кипятят до его растворения и устанавливают нейтральную

реакцию среды (рп 7,0). Среду стерилизуют при 1 атм  в течение 20 мин.

Пивное сусло. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при

35°С. После того  как ростки будут вдвое больше  длины зерна, последнее

высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании) и

получают солод. Для приготовления сусла солод  крупно размалывают и 250 г

его берут на 1 л воды. Смесь подогревают при 57°С (для лучшего выделения

фермента амилазы) до исчезновения реакции на крахмал (синее окрашивание с

йодом). Пробы  на осахаривание крахмала проводят в  фарфоровой чашке в капле

жидкости. Сусло  процеживают через вату, затем  фильтруют через бумажный

фильтр. Такое  сусло содержит 10— 20% сахара. Определив  его содержание по

плотности раствора с помощью сахариметра, сусло разбавляют водой до

концентрации  сахара 6—8%, стерилизуют при 115°С (давление 0,5 атм) в

течение 30 мин. Готовое  сусло можно получить на пивоваренном заводе. Сусло-

агар. К приготовленному  суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до его

расплавления, фильтруют  через вату и стерилизуют таким  же способом, как

пивное. Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных  сред употребляют

снятое молоко, так называемый обрат (жир в молоке неблагоприятно влияет на

рост некоторых микроорганизмов). Обрат получают сепарированием молока,

нагретого до 34°С. Жир можно удалять и при  отстаивании молока. При

стерилизации  молока следует учитывать, что его  нельзя длительное время

выдерживать в  автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в

молоке, может  карамелизоваться. Обезжиренное молоко разливают в стерильные

пробирки и  выдерживают при 115°С (давление 0,5 атм) 15 мин. Перед

стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе

молоко свернется. После стерилизации его выдерживают трое суток в

термостате при 30°С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других

стойких к нагреванию форм. Через 3 дня каждую пробирку с  молоком

просматривают и пробирки, в которых развились  микроорганизмы,

выбраковывают. При стерилизации в автоклаве иногда наблюдается побурение

молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина.

При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина,

который может  частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко    в

качестве    среды    использовать нельзя. Дрожжевые среды. Дрожжевая вода.

50—100 г сухих  дрожжей размешивают в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют

через бумажный фильтр и стерилизуют текучим  паром по полчаса в течение  трех

дней ежедневно. Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в

1 л воды, добавляют  2 г Na2HPO4, 1 н. раствор NaOH (до рН 6,1) и 5 мл

хлороформа, выдерживают  при 37°С двое суток, доводят до рН 7,4, кипятят 30

мин, фильтруют  через бумажный фильтр, разливают  в посуду и стерилизуют при

115°С полчаса.  Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных  дрожжей разводят в 1 л

воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через  бумажный фильтр и

стерилизуют при 115°С 30 мин. Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой)

заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не

разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют  к нему 10 г

сахара и доводят  до первоначального объема. Устанавливают  слабощелочную

реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют  в автоклаве при давлении

пара 1,5 атм в  течение 30 мин. 

                         Элективное культивирование. 

Познанием многообразия  микроорганизмов  мы  обязаны  двум  обстоятельствам.

Некоторые микроорганизмы уже сравнительно давно привлекли  к  себе  внимание

вследствие того, что они образуют колонии  или  скопления  или  же  вызывают

какие-либо заметные изменения в окружающей среде.  Многие  из  таких,  легко

обнаруживаемых  микроорганизмов поддаются прямому  выделению; относите  л  ьпо

нетрудно подобрать условия, которые обеспечивали  бы  их  рост.  Существуют,

однако, и многие другие микроорганизмы  (различных  физиологических  типов),

ставшие доступными для исследования лишь  после  того,  как  Виноградский  и

Бейерипк разработали  технику  накопительных  культур.  И в принципе  и на

практике метод  очень  прост.  Подбором  ряда  факторов  (источники  энергии,

углерода и  азота; акцептор  электронов;  свет;  температура;  рН  и  т.  п.)

создают определенные  условия  и  инокулируют  среду  смешанной  популяцией,

какая имеется, например, в почве или в иле. В такой  среде  наиболее  хорошо

приспособленный к пей тип микроорганизмов  растет и вытесняет все  остальные,

сопутствующие, организмы. Посредством многократных пересевов в жидкую  среду

такого же состава и рассева по  такой  же  плотной  среде  можно  без  труда

выделить  накопленный  штамм.  Частый  пересев  с  жидкой  среды  на  жидкую

предотвращает рост сопутствующих организмов, которые  могли  бы  использовать

продукты выделения  или даже автолиза клеток первичной культуры  и  расти  за

счет них. Прекрасным материалом для инокуляции служат  пробы  из  тех  мест,

где   уже   имеется   «естественное   обогащение».   Так,   можно   выделять

микроорганизмы,  использующие  окись  углерода,  из  сточных   вод   газовых

заводов; микроорганизмы, использующие гемоглобин, — из сточных  вод  боен  и

бактерии,  окисляющие  углеводороды,  —  из  нефтеносных  пород,  из   почв,

загрязненных  нефтью, и из нефтяных отстойников. Метод накопительных  культур

позволяет  выделять  микроорганизмы  с  любой  комбинацией  потребностей   в

питательных веществах  при  условии,  разумеется,  что  искомый  тип  вообще

существует  в  природе.  Для   крайне   специализированных   микроорганизмов

особенно легко  создать  элективные  условия.  Так,  минеральная  среда,  не

содержащая связанного азота, на свету строго избирательна для  "сине-зеленых

водорослей,  фиксирующих  N2.  Если  ту  же  среду  дополнить   органическим

источником энергии  и углерода, то на  ней  в  темноте  в  аэробных  условиях

будет  развиваться  Azotobacter,  а  при  исключении   доступа   воздуха   —

Clostridium.  Для   успешного  получения  накопительных   культур   требуется

ограничиться   удовлетворением   минимальных   потребностей   только    того

микроорганизма, который  хотят  выделить.  Если,  например,  хотят  выделить

бактерии, способные  окислять метан или водород с  нитратом  или  сульфатом  в

качестве акцептора  водорода, то следует позаботиться об  исключении  доступа

кислорода, иначе  будут доминировать аэробные  формы,  окисляющие  метан  или

водород. Для  отбора можно также использовать устойчивость или  толерантность

микроорганизмов к кислотам и щелочам, к высоким  температурам пли  излучению.

Нередко наряду с «положительной»  селекцией  проводится  и  «отрицательная»—

при помощи  избирательно  действующих  ингибиторов.  На  питательной  среде,

содержащей  азид,  в  аэробных  условиях  растут,  например,   молочнокислые

бактерии, а рост других аэробных микроорганизмов подавляется.  Азид,  цианид

и H2S оказывают избирательное действие па те аэробные организмы,  в  дыхании

которых  участвуют   цитохромы.   В   медицинской   диагностике   пользуются

избирательным  подавлением  для  обнаружения   Corynebacterium   diphtheriae

(применение   питательных   сред,  содержащих   теллурит)   и    патогенных

Enterobacteriaceae (агаризованные  среды с добавлением висмута).  В  посевном

материале могут  присутствовать различные штаммы с  одинаковым  типом  обмена

веществ, отличающиеся друг от друга лишь  незначительно,  например  лишь  по