Рис. 2.1 - Структура нативной молекулы белка (в центре) и трёх денатурированных молекул этого же белка.

3. Детергенты

  Детергенты (от лат. detergere — мыть, очищать) представляют собой поверхностно-активные вещества с моющим действием, которое обусловлено их способностью образовывать в воде устойчивые коллоидные растворы. Поверхностная активность детергентов, то есть способность адсорбироваться на границе раздела фаз (типа вода—воздух или вода—масло), связана с амфифильностью их молекул. Амфифильными (от греч. фило — любящий и амфи — обоих) называют вещества, в молекулах которых имеются четко разграниченные гидрофильные и гидрофобные области, благодаря чему такие молекулы обладают сродством не только по отношению к воде, но и к неполярным органическим растворителям.

  В воде молекулы детергентов стремятся ассоциировать друг с другом, давая мицеллы (рис. 3.1). Эти агрегаты состоят из большого числа детергентных молекул (обычно от нескольких десятков до нескольких сот), ориентированных в мицелле таким образом, что их неполярные группы формируют внутреннее гидрофобное ядро мицеллы, а гидрофильные полярные группировки находятся на ее поверхности и контактируют с окружающими молекулами воды. 

  

    

    

   Именно благодаря наличию гидрофобного ядра мицеллы способны солюбилизировать, то есть переводить в раствор неполярные вещества, практически нерастворимые в воде. В качестве параметров, характеризующих способность детергентов к мицеллообразованию, обычно используют критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) и число агрегации. ККМ — это та концентрация, при которой детергент начинает образовывать мицеллы. До этого он находится в воде в мономерной форме в состоянии истинного раствора. Число агрегации показывает, сколько молекул детергента приходится на одну мицеллу.

В настоящее время известно несколько сот различных детергентов. Все они разделяются на два основных класса: ионные и неионные детергенты в зависимости от наличия или отсутствия заряженных групп в гидрофильной области их молекул.

   Неионогенные ПАВ растворяются в воде, не ионизируясь. Растворимость неионогенных ПАВ в воде обуславливается наличием в них функциональных групп. Как правило, они образуют клатраты в водном растворе вследствие возникновения водородных связей между молекулами воды и атомами кислорода полиэтиленгликолевой части молекулы ПАВ. К ним относятся: полигликолевые эфиры жирных спиртов и кислот, полигликолевые эфиры амидов жирных кислот, ацилированные или алкилированные поли гликолевые эфиры алкиламидов. Ярким представителем неионогенных ПАВ является Тритон Х-100 . Добавление этого сурфактанта в раствор зачастую улучшает растворимость белка, при этом не вызывая его денатурацию.

   Основную  долю в фармацевтических, косметических, медицинских и биохимических  исследованиях составляют ионные детергенты, с их помощью влияют на энергетическое состояние и структуру межфазной поверхности и через неё регулируют свойства микрогетерогенных систем.

   Благодаря высокой поверхностной активности и способности к растворению  белков и липидов, а также способности вызывать диссоциацию и денатурацию белков, инактивацию вирусов и токсинов именно ионные детергенты широко применяются для приготовления медицинских фармацевтических препаратов (например, бактерицидных и дезинфицирующих), а также дерматологических и косметических средств.

   Ионные детергенты по типу заряда делятся на катионные, анионные, и цвиттерионные (амфотерные).

    Анионные ПАВ - это соединения, которые в водных растворах диссоциируют с образованием анионов, обусловливающих поверхностную активность. Среди них наибольшее значение имеют линейный алкилбензосульфонат, сульфаты и сульфоэфиры жирных кислот. Широко используемым примером является детергент, додецилсульфат натрия (рис. 3.2).

    Катионные ПАВ в водном растворе диссоциируют с образованием катионов, определяющих поверхностную активность. Среди катионных ПАВ наибольшее значение имеют четвертичные аммониевые соединения, имидазалины и жирные амины. Одним из ярких представителей катионных детергентов является цетавлон (ЦТАБ) (рис. 3.3).

   Детергенты изменяют конформацию белка, в связи с этим исследование взаимодействия ПАВ, как ДСН и ЦТАБ, является важной задачей.

 

 
4. Денатурация под действием ионных детергентов

   Гидрофобные радикалы белков взаимодействуют с  гидрофобными частями детергентов, что изменяет конформацию белков. Денатурированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирующего вещества удерживают его в растворе. К наиболее известным детергентам относят различные мыла (рис. 4.1).  

   

   Рис. 4.1 - Денатурация белков с помощью детергентов. 

   Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты, среди которых в биохимической практике особенно часто используют анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) и катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ, цетавлон).

   Взаимодействие белков с детергентами может изучаться различными методами: дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC), с помощью кругового дихроизма, флуоресценции и УФ-спектроскопии поглощения.

   Рассмотрим на примере исследования денатурации сывороточного альбумина человека (САЧ) под действием ионных детергентов по анализу собственной триптофановой флуоресценции белка.

   На рис. 4.2 изображены зависимости интенсивности в максимуме спектров триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека от концентрации ДСН для различных значений pH. Видно, что в растворах с ДСН триптофановая флуоресценция сывороточного альбумина человека тушится. Тушение триптофановой флуоресценции белка в растворах с ДСН объясняется его денатурацией, вследствие которой при разворачивании белковых глобул хромофорная группа триптофана альбумина становится более доступной для молекул воды, тушащих её свечение.

   Из рис. 4.2 видно, что более сильное тушение собственной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина, наблюдаемое в растворах с ДСН, при одинаковых концентрациях ДСН имеет место при более низких значениях pH. Данная закономерность говорит об электростатическом механизме взаимодействия сывороточного альбумина человека с ДСН. ДСН в растворе диссоциирует на положительно заряженные катионы натрия и додецилсульфат-анионы, которые и взаимодействуют с белком. Молекулы сывороточного альбумина человека в целом заряжены положительно при pH, меньших pI альбумина.

   Поэтому при низких значениях pH происходит интенсивное связывание в целом положительно заряженных макромолекул белка с додецилсульфат-анионами, вследствие чего происходит сильное тушение триптофановой флуоресценции альбумина. По мере увеличения pH в целом положительный заряд макромолекулы альбумина уменьшается, а при pH, больших pI, макромолекулы альбумина приобретают в целом отрицательный заряд. Поэтому при высоких значениях pH (больших pI) происходит слабое связывание додецилсульфат-анионов и в целом отрицательно заряженных молекул альбумина, хотя еще и сохраняющих какие-то положительно заряженные участки на своих поверхностях, вследствие чего в растворах с ДСН происходит слабое тушение триптофановой флуоресценции альбумина. Следовательно, более сильная денатурация белка под действием ДСН имеет место при pH, меньших pI белка.

   Установленные из экспериментальных данных зависимости интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека при различных значениях pH от концентрации ДСН (рис. 4.2) можно объяснить двустадийным механизмом денатурации этого белка в присутствии ДСН. первая переходная стадия денатурации белка – разрыхление белковых глобул, вторая стадия денатурации – разворачивание аминокислотной цепи белка.

   . При концентрациях ДСН, меньших 1 мМ, происходит тушение триптофановой флуоресценции альбумина для всех pH, что указывает на первую стадию денатурации сывороточного альбумина человека – разрыхление глобул.

   Дальнейшее  увеличение (больше 1 мМ) концентрации ДСН при pH, больших изоэлектрической точки альбумина (pI 4,7) имеет практически постоянные значения интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции, , следовательно, денатурация останавливается на первой стадии.

   Иной  характер зависимостей от концентрации ДСН наблюдается при pH, меньших pI белка в области концентраций ДСН от 1 мМ до 2 мМ интенсивность в максимуме спектра триптофановой флуоресценции имеет практически постоянные значения. При этих концентрациях ДСН (до 2 мМ) происходит первая переходная стадия денатурации белка: белковые глобулы разрыхляются, но полного разворачивания еще не произошло. При дальнейшем увеличении концентрации ДСН до 3 мМ происходит дальнейшее тушение триптофановой флуоресценции альбумина, что говорит о том, что белковые молекулы из переходного состояния разрыхленности переходят во вторую стадию денатурации - стадию полного разворачивания. При увеличении концентрации ДСН свыше 3 мМ (до 7 мМ) более сильного тушения триптофановой флуоресценции альбумина не происходит, что указывает на полную денатурацию молекул альбумина. Следовательно, подобное двухэтапное тушение собственной флуоресценции белка при увеличении концентрации ДСН при этих значениях pH, меньших pI белка, объясняется двустадийным механизмом его денатурации и последовательными конформационными перестройками белковой глобулы, приводящими к оголению триптофана и увеличению его доступности для молекул воды, тушащих его флуоресценцию.

   На рис. 4.3. изображена зависимость квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов. Из этой зависимости следуют аналогичные выводы о денатурации САЧ под действием ДСН. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   

   

   

     
 

   Рис. 4.2 - Зависимость интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     
 

   

     
 
 

   Рис. 4.3 - Зависимости квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   На рис. 4.4 изображены зависимости квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ЦТАБ при рН, больших pI белка.

    Видно, что в растворах с ЦТАБ триптофановая флуоресценция сывороточного альбумина человека тушится. Тушение триптофановой флуоресценции белка в растворах с ЦТАБ объясняется его денатурацией, вследствие которой при разворачивании белковых глобул хромофорная группа триптофана альбумина становится более доступной для молекул воды, тушащих её свечение.

   Из рис. 4.4 видно, что более сильное тушение собственной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина, наблюдаемое при одинаковых концентрациях ЦТАБ имеет место при более высоких значениях pH. Данная закономерность говорит об электростатическом механизме взаимодействия сывороточного альбумина человека с ЦТАБ. ЦТАБ в растворе диссоциирует на отрицательно заряженные анионы брома и цетилтриметиламмоний-катионы, которые и взаимодействуют с белком.

   При высоких значениях pH (больших изоэлектрической точки белка) макромолекулы белка в целом заряжены отрицательно, поэтому происходит сильное связывание цетилтриметиламмоний-катионов с молекулами белка, флуоресценция белка в растворах ЦТАБ тушится сильно. По мере уменьшения pH отрицательный заряд молекулы альбумина уменьшается, связывание происходит более слабо, поэтому и квантовый выход флуоресценции альбумина в растворах ЦТАБ уменьшается слабее.

   При дальнейшем уменьшении pH, при значениях рН, меньших изоэлектрической точки, макромолекулы белка становятся заряжены в целом положительно, но при этом сохраняются и отрицательно заряженные участки. В связи с этим происходит слабое связывание САЧ с катионами ЦТАБ и триптофановая флуоресценция альбумина тушится слабо в растворах с ЦТАБ по сравнению с растворами, не содержащими ЦТАБ.

   Видно, что денатурация альбумина под действием ЦТАБ носит одностадийный характер при всех значениях рН.

   Процесс денатурации под действием обоих детергентов носит электростатический характер, в связи с этим, характер процессов денатурации белка отличается в зависимости от значений рН.