Генная инженерия

    Методы, позволяющие вести экспрессионное профилирование: субстракционная гибридизация, электронное сравнение EST-библиотек, «генные чипы» и так далее. Они позволяют устанавливать корреляцию между тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных генов.

    Позиционное клонирование, заключается в создании за счет инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего гена как такового, который заведомо содержит известную последовательность (инсерция).

    Вышеназванные методы не предполагают никаких изначальных сведений о генах, контролирующих тот или иной признак. Отсутствие рационального компонента в данном случае является положительным обстоятельством, поскольку неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и генном контроле конкретного интересующего нас признака.

    Кроме всего этого группа ученых, таких  как Марк Адам (ведущий сотрудник института геномных исследований в штате Мэриленд – США,  частной исследовательской компании, занимающейся исключительной работой в области картирования генов), Крэйк Вентер (директор этого института) и соавторами, разрабатывается проект «Геном человека». Цель этого проекта заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причину многих наследственных заболеваний и этим открыть пути к их лечению. Что бы последовательно приближаться к решению проблемы картирование генов человека, было сформулировано пять основных целей:

    - завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии не превышающем в среднем 2 млн. оснований (1 млн. оснований принято называть мегобазой);

    - составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0.1 Мб);

    - получить карту всего генома в виде охарактеризованных клонов (5 тыс. оснований в клоне или 5 Кб);

    - завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение одного основание);

    - нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 году).

    Ожидалось, что, когда все указанные цели будут постигнуты, исследователи определят все функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных.

    Рассмотрев  темпы ускорения работы в рамках проекта «Геном человека», руководители этого проекта объявили 23 октября 1998г., что программа будет полностью завершена гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали «Новые задачи проекта «Геном человека»:

    - полностью завершить в декабре 1998 года работу по секвенирование генома «Круглого червя» c. Elegans (это было сделано в срок);

    - закончить предварительный анализ последовательности ДНК человека к 2001 году, а полную последовательность к 2003 году;

    - картировать к 2002 году геном плодовой мухи;

    - начать секвенирование генома мыши с использованием методов ДНК искусственных хромосом дрожжей (завершить этот проект к 2005 году). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

        
 
 
 
 
 
 
 
 

        2.3.1. Что будет сделано после завершения анализа генома человека

     Главная стратегическая задача будущего сформулирована следующим образом: изучить однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах и клетках отдельных индивидуумов и выявить различия между индивидуумами. Анализ таких вариаций даст возможность не только подойти к созданию индивидуальных генных портретов людей, что в частности даст возможность лечить болезни, но  и определить различия между популяциями. А также выявлять географические районы повышенного риска, что поможет давать чёткие рекомендации о необходимости очистки территории от загрязнения и выявить производства, на которых есть большая опасность поражение геномов персонала.  

     Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания всеобщего блага, но и вполне осознанную тревогу юристов  и борцов за индивидуальные права  человека. Так, в частности, высказываются  возражения против распространения  персональной информации без решения тех, кого она касается. Один пример помогает понять эти тревоги: уже сейчас страховые компании нацелились на добывание таких сведений правдами и неправдами, они намериваются использовать данные против тех, кого они страхуют. Например, если подающий на страховку несёт потенциально болезнетворный ген, компании не хотят страховать таких людей вовсе или же пытаются заломить бешенные суммы за их страховки. Исходя из этого, конгресс США уже принял ряд законов, направленный на строгий запрет распространения генетической информации относительно отдельных людей, юристы всего мира интенсивно работают в данном направлении.     
 
 
 
 
 

                3. Предпосылки формирования генной инженерии

        3.1. Открытие двойной структуры ДНК и матричного синтеза

    Начальные работы американских учёных Уотсона и Крика были произведены в 1953 году. Они дали возможность развиваться генной инженерии в качестве самостоятельного раздела науки. Эти открытия заключены в следующем:

    Была  открыта двойная структура ДНК  и постулирован её матричный синтез. Двойная спираль ДНК при репликации разделится и вдоль нити ДНК, специальные ферменты-полимеры, собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Таким образом дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Итак, в клетках живого организма возможен особый тип реакции – матричный синтез. Одна молекула – матрица, а вторая строится по её программе. Репликация ДНК, синтез всех видов РНК и сборка молекул белка, в соответствии со структурой иРНК – это все варианты матричного синтеза, который происходит всегда при участии нуклеиновых кислот.

    По  тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация ДНК (необходима для передачи наследственной информации дочерним клеткам), транскрипция (синтез иРНК в ядре клетки) и трансляция (сборка белковой цепи на иРНК при помощи рибосомы).

      Казалось бы, что на рубеже 70-х  годов молекулярная биология  достигла определённой степени  завершенности: были установлены  структура и механизм репликации ДНК, провозглашена «центральная догма» экспрессии гена (транскрипция и трансляция), выявлены основные аспекты регуляции активности гена. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам (включая человека) встретился с дополнительными проблемами и трудностями, и кроме того, существовавшие в то время методы не позволяли рассчитывать на получение принципиально новых результатов. Стремительный порыв в развитии молекулярной генетики в начале 70-х годов стал благодаря появлению нового экспериментального инструмента – рестриктационных эндонуклеаз. Был открыт путь для широкомасштабного получения генных продуктов (физически значимых белков) и для генетического манипулирования с различными организмами.

    В прошлом генетика и медицинская  генетика развивалась как относительно независимые отрасли науки, теперь многие из их разделов оказались вовлечённые  в общее русло молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань – трудно.

    Сейчас, множество ученых заняты различными работами связанные с проблемами генной инженерии – это и методы, основанные на использовании рестриктационных ферментов, анализ гена человека, методы гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, сортировки хромосом при помощи цитофиурометрии и многое, многое другое.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

        3.2. Принципы технологий рекомбинантных ДНК

    Было  выделено много рестриктаз (более 150), расщепляющих ДНК в специфических сайтах. Например эндонуклеаза  R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца:

             ¯

          G-A-A-T-T-C

          |||  ||  ||  ||  ||   |||

          C-T-T-A-A-G

                             ­    

    Липкие  концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут  вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются по тем сайтам   ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфического определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, необходимых для ДНК

или  для изучения механизмов экспрессии генов. Последняя  проблема наиболее важна в практическом аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков теперь можно вводить в бактерии и размножать (амплифицировать). Эта процедура называется клонированием генов. Благодаря ей появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принципе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК, называемые плазмидами.

    Плазмиды  реплицируются автономо и сами могут  содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например: колицинов, убивающих другие бактерии (рис.1).

    Плазмидную  ДНК можно выделить и расщепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.

Фрагменты любой  чужеродной ДНК с такими же липкими  концами (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы.

Рис. 1. Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой.

      Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется ( рис.2 )

    Источник  экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать  и искусственно синтезированные гены. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов (носителей) ДНК используют фаги λ (объект исследования Альберта). Часть генома этого фага не обязательна для его размножения в бактерии. Вместо него можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой после инфицирования бактерий. 

    Добиться  репликации и амплификации в составе  плазмидной (или фаговой) ДНК после  трансформации бактериальной клетки ещё не значит решить все её проблемы. Прежде всего возникают два вопроса:

1. Как распознавать клоны, содержащие гибридную ДНК, среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофагов ?
2. как идентифицировать необходимые фрагменты ДНК среди многих клонированных неизвестных фрагментов?

    Например  можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, на среде, содержащей антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид(и, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде. В последнее время разработано много специальных методов вакцинации, которые позволяют отбирать только рекомбинантные клетки.

    Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определённые фрагменты ДНК, необходимо ещё индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого  необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу ДНК , последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном , так и на трансляционных уровнях.      
 
 

                     

         3.3. Идентификация и анализ генов

     Ещё одна область применения рестриктаз – идентификация и определение числа генов. Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном.