Генотипическая изменчивость

Комплементация - это такое  взаимодействие вирусов, когда один их них, или оба, предоставляют друг другу недостающие белки для  размножения и развития. Комплементация может активизировать изначально не жизнеспособные вирусы. Примером может  служить покрытие дельта-вируса белком вируса генотипа В-Hbs- антигеном.

Фенотипическое смешивание - это процесс при котором геном  одного из вирусов оказывается заключенным  в капсид другого. Фенотипическое смешивание наблюдают при совместном культивировании  вирусов.

 

13. Методы молекулярно-генетического  анализа

 

Изучение генома микроорганизмов  осуществляют с помощью методов  молекулярно-генетического анализа. Известные в наше время методы этого анализа характеризуются  сложностью, высокой чувствительностью  и точностью.

Основным способом генетического  анализа считают метод молекулярной гибридизации. Сущность способа заключается  во взаимодействии комплементарных  цепей ДНК или РНК, в результате которого образуются двунитчатые структуры. Гибридизация может осуществляться между комплементарными молекулами ДНК и ДНК, ДНК и РНК, РНК  и РНК. Гибридизация осуществляют поэтапно. Сначала деспирализуют генетический материал с целью получения одноцепочных структур, затем адсорбируют его  на нитроцеллюлозной мембране. Следующим  этапом является обработка материала  зондом, который представляет собой  короткую последовательность нуклеиновой  кислоты, комплементарной исследуемой  кислоте и меченную радиоактивным  фосфором. После обработки материала  зондом, исследуемые пробы помещают в специальный счетчик. Искомую  последовательность нуклеиновой кислоты  в материале определяют по степени  радиоактивности пробы. Метод высокочувствителен, т. к. позволяет выявить до 10-10 г. нуклеиновой кислоты в 1 г. материала.

В начале 80-х годов К. Мюллисом был разработан способ под названием  полимеразная цепная реакция (ПЦР). Суть этого метода сводится к следующему. Исследуемый материал нагревают  до 90-100 ºС, что приводит к раскручиванию 2-х цепочной ДНК на отдельные цепи. После расхождения цепей ДНК, к ним добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют (накапливают). Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. В результате синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяют снова и снова. При каждом повторе цикла количество ДНК гена будет увеличиваться в 2 раза. Для проведения реакции необходимы специальные приборы - амплификаторы.

Этот метод позволяет  обнаружить 100 молекул ДНК или  РНК в 1 г. исследуемого материала, т. е. является самым высокочувствительным методом из всех известных в настоящее  время.

ПЦР применяют для диагностики  вирусных и бактериальных инфекций, анализ рекомбинаций фагов

Естественно, что гибридизация фагов, происходящая в период их внутриклеточного размножения, не может быть обнаружена, если клетка заражается фаговыми частицами  одного генотипа. Не обнаруживается она  и при смешанном заражении  мутантом и нормальным фагом, так  как гибридизация может быть выявлена лишь по рекомбинации признаков фагов  двух генотипов. Накопление различных  мутантных линий фагов оказалось  необходимой предпосылкой проведения гибридизационной работы с фагами.

Очевидно, что для изоляции рекомбинантов необходимо различие между исходными формами минимум  по двум признакам. Такой опыт был  впервые проведен с фагом Т2 при  смешанном заражении клеток Echerichia coli мутантами hR и Hr. В потомстве фагов, освобожденном при лизисе клеток, были обнаружены частицы дикого типа (Т2 НR)I и двойного мутанта. Появление таких рекомбинантных генотипов говорило о том, что при размножении фаговых частиц двух генотипов в одной бактерии происходит в той или иной форме гибридизации.

Для генетика возможно при  обнаружении рекомбинантов количественно  оценить частоту, с которой они  появляются.

Рассмотрим скрещивание  у фага Т4 между тройным мутантом (m r tu) и фагом дикого типа (M R Tu). В  потомстве от смешанного заражения  такими фагами наблюдались частицы  восьми генотипов - следовательно, все  рассматриваемые гены рекомбинируют. Если бы они рекомбинировали свободно, то все восемь классов в потомстве  появились бы с равной численностью. В действительности же резко преобладают  родительские типы (m r tu и M R Tu). Так, в  одном опыте среди 10342 колоний  было найдено родительских генотипов: m r tu - 3467, M R Tu - 3729; рекомбинантных: m R Tu - 520, M r tu - 474, m r Tu - 853, M R tu - 965, m R tu - 162, M r Tu - 172. Помимо преобладания родительских генотипов в потомстве, обращает на себя внимание и приблизительное  равенство численностей взаимодополняющих  рекомбинантных классов (например, m R Tu и M r tu), т.е. картина расщепления выглядит также, как картина расщепления  в мейозе тригетерозиготы по специальным  генам у любого высшего организма. Если это так, то можно по законам  расщепления вычислить частоту  встречаемости рекомбинантов.

Определим частоту рекомбинации для пары генов m и r, т.е. отношение  числа рекомбинантов по этим генам  к общему числу потомков:

(520+474+162+172) / 10342 =0,129

для пары r и tu частота рекомбинации будет равна 0,208, а для пары m и tu - 0,271. из этих результатов следует, что все три гена сцеплены и  могут быть линейно расположены  в порядке m-r-tu. Понятно, что найденная  частота рекомбинации пары m и tu занижена, так как при ее определении  не были учтены двойные обмены (генотипы m R tu и M r Tu).

Итак, генетический анализ рекомбинации у фагов может проводиться  также, как и в генетике высших организмов. Анализ разнообразных скрещиваний  у фага T4 показал, что все изученные  гены фага могут быть расположены  в линейном порядке в одной  группе сцепления, причем расстояние между  генами измеряются частотой рекомбинации их в потомстве. Такие же результаты были получены и для других фагов.

Гибридологический анализ при  трансдукции.

Анализ аллельности с  использованием абортивной трансдукции  был выполнен в отношении различных  мутаций у (Salmonella thyphimurium). Обнаружилось, что мутации потребности в  триптофане распадаются на 4 группы: tru A, tru B, tru C, tru D, соответствующие 4 генам. При трансдукции между мутантами  одной группы не наблюдается появления  крошечных колоний. При трансдукции  между мутантами разных групп  крошечных колоний появляется столько  же, как и тогда, когда донором  служат бактерии дикого типа. Поскольку  фаг переносит небольшие фрагменты  бактериальной хромосомы. То путем  трандукции невозможно обнаружить сцепление  и провести картирование удаленных  друг от друга генов в бактериальной  хромосоме. Если же два гена близко располагаются друг к другу, то они  могут попадать в один хромосомный  фрагмент, переносимый фагом, обнаруживая  явление сцепленной трансдукции. Оно  оказывается во многом сходным с  разбиравшимся ранее явлением сцепленной трансформации. Обозначить его можно  так:

 

АВ х ав

 

Трансдуктанты аВ, Ав, АВ.

Появление трансдуктантов АВ с двумя маркерами донора может  свидетельствовать о тесном сцеплении  генов АВ.

Сцепление может быть также  обнаружено при трансдукции Ав х  аВ, если частота трансдуктантов АВ здесь ниже, чем при трансдукции  АВ х аВ.

Действительно, если А и  В тесно сцеплены, то в первом случае фаг переносит фрагмент Ав, для образования трансдуктов  АВ необходим кроссинговер между  А и в, вероятность которого тем  меньше, чем ближе располагаются  эти гены. Во втором случае перенесенный фрагмент АВ, и трансдуканты АВ образуются, где бы не произошел кроссинговер, включающий это фрагмент в хромосому  донора.

Как в действительности сказывается  сцепление на частоте трансдуктантов в таких скрещиваниях, показывает таблица 3.

Таблица 3. влияние сцепления  на частоту трансдукции.

 

Генотип реципиентаГенотип  донораКолич. Трансдуктов дикого типа в стандартных условияхtrytru D100tryДикий  тип1822try met 151617trytry B4602trytry C3270trytry D14

Примечание. Трансдуктанты  дикого типа в скрещивании try D1 х try D10 являются результатом внутригенной рекомбинации, так как эти мутации  относятся к одному гену и являются гетероаллельными.

Очевидно, что гены try D и met 15 не сцеплены, так как частота  трансдуктантов дикого типа (АВ) не отличается от частоты их при трансдукции.

 

Дикий тип х try D10

 

Гены же try D, try В и try С  сцеплены, поскольку при трансдукции  рекомбинация между ними происходит реже.

Подробные опыты могут  дать первое представление о расстоянии между генами. Определение генетических расстояний является здесь, однако, не точным, так как в экспериментах  по трансдукции, также как и по трансформации, число рекомбинантов  не может быть отнесено к общему числу потомков, рекомбинантных и  родительских генотипов. Это происходит потому, что при трансдукции, например, АВ х ав, трансдуктанты генотипов  Ав и аВ (рекомбинантных), а также  генотипа АВ (родительского) являются в действительности результатом  двойного кроссинговера, включающего  трансдуцированный фрагмент в хромосому  донора.

14. Понятие о биотехнологии  и генной инженерии

 

Биотехнология (от греческого bios - жизнь, tecen - искусство, logos - наука) - это наука, которая на основе изучения биологических процессов в живых  организмах, использует эти процессы и организмы (бактерии, вирусы, грибы  и т. д.) для получения ценных для  человека продуктов и материалов. Биотехнология тесно связана  с производством и с ее помощью  в медицине получают антибиотики, витамины, ферменты, алкалоиды, нуклеиновые кислоты, липиды, противогистаминные, противоопухолевые  препараты, в ветеринарии - кормовой белок, кормовые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, в химической промышленности - ацетон, этилен, бутанол, в пищевой - аминокислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, кислоты, дрожжи, в энергетике - биогаз, этанол.

Генетика микроорганизмов  явилась основой для становления  и развития одной из областей биотехнологии - генной инженерии. Генная инженерия  связана с конструированием клеток с новыми генетическими свойствами. По своей сущности она сводится к  генетической рекомбинации, т. е. получению  новых рекомбинантных молекул ДНК  с заданной генетической информацией. Процесс получения рекомбинантных ДНК состоит из нескольких последовательных стадий. Первая стадия сводится к выделению  необходимой экспериментатору ДНК  из клеток интересующего организма. Затем получают рекомбинантную (гибридную) ДНК путем встройки в геном  клетки гена или группы генов, кодирующих требуемый белок (гормон, фермент  и др.). после этого, рекомбинантную ДНК вводят в живую клетку (животную, растительную, микробную), которая является своего рода биофабрикой, синтезирующей  большое количество различных соединений. Наконец, получают клон клеток, обладающих нужными признаками, его размножают, создают условия для максимального  проявления синтезирующей способности  клонированных клеток и выделяют необходимый продукт.

Опыты по генной инженерии.

Для получения разнообразных  белков эукариот и вирусов животных широко применяются бактерии и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

При этом используются самые  разные методы, но наиболее широко те из них, которые описаны ниже.

Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если ген  животного должен экспрессироваться  в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую  м-РНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных  клетках не удается, поскольку эти  гены содержат интроны.

Некоторые гены животных, например, кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо  экспрессироваться в бактериальных  и дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать м-РНК, то прежде всего следует найти  ее источник - ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую м-РНК.

После транскрипции данной м-РНК и получения комплементарной  ДНК (к-ДНК) необходимо определить, какие  из множества молекул этой к-ДНК  ген, подлежащий выделению из экспрессии. На этом этапе работы молекулы к-ДНК  обычно вводят в состав плазмид или  генома бактериофагов, которые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами к-ДНК  переносят в клетки находящихся  бактерий-хозяев.

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы.

Обычно выбор вектора  определяется штаммом хозяина, который  используется для экспрессии клонированной  ДНК. Если в роли хозяина выступает  Е. coli, плазмидный вектор скорее всего  представляет собой производное  рВР322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cereuisiae конструируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосом дрожжей, способных  реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные  векторы, которые могут реплицироваться  в одном или нескольких организмах-хозяевах. Применение таких векторов оказывается  весьма перспективным в связи  с тем, что нередко для наработки  большого количества плазмид и для  трансформации ДНК удобнее в  роли хозяина использовать E. сoli.

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и  той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые  затем отжигают, получают кольцевую  рекомбинантную молекулу и сшивают  ДНК-лигазой фага Т4. в случае плазмиды рВР322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности  обеспечивать устойчивость.