Регламент на производство инсулина генно-модифицированным методом

       ВР 2.2. Подготовка оборудования

                     Требования к подготовке оборудования:

1. Оборудование должно быть сконструировано и размещено таким образом, чтобы его эксплуатацию, обслуживание и ремонт можно было производить за пределами «чистых» помещений;
2. Оборудование, используемое для работы в асептических условиях, должно иметь регистрирующие устройства для контроля параметров процессов и наличие устройств сигнализации  о неисправности его;
3. Оборудование должно очищаться, дезинфицироваться и при необходимости стерилизоваться;
4. Должен производиться контроль оборудования на микробиологическую чистоту;
5. Рабочая поверхность оборудования должна быть гладкой, из нетоксичного и устойчивого к коррозии материала.

       ВР 2.3. Подготовка персонала

                    Требования, предъявляемые к персоналу:

1. Персонал должен иметь определенный минимум знаний по гигиене, санитарному режиму и правилам GMP;
2. К работе не допускаются сотрудники, имеющие инфекционные заболевания, открытые раны на коже и являющиеся носителями патогенной  микрофлоры;
3. Запрещается разговаривать, принимать пищу, быстро передвигаться в производственном помещении;
4. Строго соблюдать личную гигиену, удалять косметику с лица и снимать украшения перед входом в «чистые» помещения;
5. Принять душ, вымыть и обработать руки дезинфицирующими средствами, надеть комплект  стерильной технологической одежды и обуви.

         ВР 3. Синтез цепей А и В.

       Синтез  цепей проводят химическим методом. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, цепь Б - 30 остатков

       ВР  4. Введение генов в плазмиду.

       Для того, чтобы плазмида могла принять  в себя чужеродный ген, ее цепочку  разрезают ферментами – рестриктазами. Для сшивания генов, кодирующих синтез цепей А и В используют олигосахаридные  остатки различной длинны – линкеры и адапторы. Когда молекула замкнулась, ее можно вводить в пермиссивную клетку.

       ВР 5 . Введение р-ДНК  в пермиссивную клетку.

       Введение  р=ДНК в клетку E.coli проводят методом микроинъекции: в клетку E.coli специальной ультратонкой стеклянной иглой вводят плазмиду, содержащую векторную ДНК.

       ТП 6. Подготовка питательной среды

       Основной  питательной средой для культивирования  культуры E.coli является бульон по Миллеру. Состав: гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, агар-агар. Конечное значение рН (при 25°С) 7,0±0,2.Так же используется бульон Хоттингера. Состав: гидролизат Хоттингера, натрия хлорид, вода дистиллированная.

       Стерилизацию  питательной среды проводят в  автомате для непрерывной стерилизации – УНС. Питательная среда последовательно проходит секцию нагревания, секцию выдерживания и секцию охлаждения.

       ТП  7. Культивирование суспензионной культуры

       Выращивание биокультуры проводят в биореакторах, суспензионная культура в которых перемешивается за счет подачи воздуха в биореактор. Процесс проводится в полупериодическом режиме, когда в биореатор постоянно добавляют определенный объем свежей питательной среды и одновременно забирают тот же объем клеточной суспензии..

       ТП  8. Выделение культуры ткани.

       Отделение культуры ткани от питательной среды проводят методом седиментации (осаждения) в седиментаторах, более глубокое разделение обеспечивается фильтрованием щадящим методом для сохранения целостности клеток культуры.

       ТП 9. Очистка

       Очистку инсулина проводят методами хроматографии: фронтальной, гельпроникающей, анионообменной. Очистка инсулина  и его производных на сорбентах с сильными катионообменными свойствами (например SP-Sepharose FF) можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины (до 2 М и менее).

       ТП 10. Получение молекулы инсулина

       Выделенные  и очищенные цепи подвергают фолдингу и окислению, которое обеспечивает образование соответствующих дисульфидных мостиков.

       ТП  11. Сушка

       Сушка продукта проводится в сублимационной сушилке.

       ТП  12. Оценка качества готовой продукции.

       Внешний вид (соответствует описанию), активность (биологическим методом).

       УМО 13. Упаковка, маркировка, отгрузка.  

Раздел VII. Методы анализа 

       Активность  инсулина измеряется в единицах действия (ЕД) или в международных единицах действия (МЕ - русск. или IU - англ. или UI - франц.). 1 единица соответствует активности 1/24 мг (41,66 мкг) кристаллического инсулина.

       Фредерик  Бантинг в 1922 году предложил считать  единицей действия инсулина такое количество кубических сантиметров экстракта поджелудочной железы, которое в течение 2-4 часов доводило здорового кролика до гипогликемии с уровнем СК 2,5 ммоль/л. Чуть позже в том же году тем же коллективом была предложена "мышиная" единица - количество инсулина, необходимое для доведения до конвульсий половины экспериментальной группы мышей (исследователи здесь сначала действовали по аналогии с LD50).

       На  следующий год Международный  комитет по стандартизации принял такое  определение единицы действия инсулина: "количество инсулина, потребное  для снижения уровня глюкозы крови до уровня, при котором начинаются судороги у кроликов весом 2 кг, не получавших пищу в течение 24 часов". Эта единица в честь Торонтской группы Бантинга и Беста получила название торонтской единицы действия инсулина.

       В 1925 году был введён в действие первый международный стандарт, который установил, что одна единица действия инсулина - это количество, эквивалентное 1/8 мг кристаллического инсулина.

       В связи с большим прогрессом на пути очистки инсулина и неудобством  применения столь большой единицы в 1936 году комитетом Лиги Наций был одобрен новый международный стандарт действия инсулина, который приравнивал единицу к 1/22 мг кристаллического инсулина. В 1952 году стандарт был вновь изменён и 1 единица была приравнена к 1/24,5 мг кристаллического инсулина, а в 1958 году наконец-то появился четвёртый, действующий сегодня стандарт (1 ЕД равна 1/24 мг кристаллического инсулина). ВОЗ в 1982 году внесла последние корректировки в стандарт, которые не затронули определение единицы, а касались лишь изменений, связанных с появлением человеческих генно-инженерных инсулинов. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Раздел  VIII. Техника безопасности, пожарная безопасность и

производственная  санитария 

         Каждый рабочий и инженерно-технический работник при поступлении на работу должен пройти первичный инструктаж. Первичный инструктаж проводит начальник цеха или мастер по следующей программе:

1. Основные положения законодательства об охране труда, технике безопасности, промышленной санитарии;
2. Назначение и порядок пользования специальной одеждой и средствами индивидуальной защиты;
3. Обязанности на рабочем месте;
4. Требования к правильной организации и содержанию рабочего места;
5. Общие правила электробезопасности, значение вентиляции и правила пользования вентиляционными установками;
6. Ознакомление с технологическим процессом, устройством оборудования и всеми опасными объектами.

      Все электрооборудование должно  соответствовать требованиям «Правил  эксплуатации электрооборудования». Электрооборудование должно иметь заземление. Все производственные и подсобные помещения, установки, сооружения должны быть обеспечены средствами пожаротушения и пожарным инвентарем.

       Допуск посторонних лиц в цех  запрещается.  
 
 
 
 
 
 
 
 

Раздел IX. Перечень производственных инструкций 

1. Рабочая инструкция по проведению санитарной обработке  помещений.
2. Инструкция по технике безопасности, производственной санитарии и пожарной безопасности.
3. Инструкция о порядке подготовки, сдачи и приема из ремонта оборудования.
4. Инструкции о порядке приема сырья и вспомогательных материалов;
5. План ликвидации аварии.
6. Инструкция по регенерации раствора.
7. Рабочая инструкция для аппаратчика мойки, сушки и стерилизации флаконов.
8. Инструкция для слесарей по ремонту и обслуживанию трубопроводов.