Питательные среды. Культивирование микроорганизмов

Мясопептон-агар. Агар представляет собой растительный студень, добываемый из растущих в Ост-Индии и Японии различного рода водорослей; он распускается лишь при температуре, близкой к точке кипения воды, и снова застывает уже при 40° С; благодаря своей тягучести он даже в 40° С растворе фильтруется с большим трудом, почему при приготовлении из агара питательной среды его размягчают в автоклаве при 120° или подвергают его кипячению в течение нескольких часов. К слабощелочному мясопептон-бульону прибавляют 1,5-2% агара, колбу с жидкостью ставят на час в автоклав при 120°, после чего при пользовании плантамуровской воронкой агар довольно легко проходит через фильтр. Предварительная перед фильтрацией нейтрализация жидкости не нужна, так как агар сам по себе имеет нейтральную реакцию. Профильтрованный мясопептон-агар, разлитый в пробирки, обеспложивается в один сеанс нагреванием в автоклаве при 120° в течение 1/2 часа. Если в распоряжении не имеется автоклава, то поступают следующим образом: кипятят в чугунном эмалированном котелке 20,0 агара с 3-4 литрами воды в течение 2-3 часов; к остающейся жидкости прибавляют литр бульона и снова кипятят до получения одного литра; этим путем точно так же получается хорошо фильтрующийся агар (Н. Шульц). К агару, а равно и к желатине, для той или другой специальной цели прибавляют часто различные другие вещества. Так, прибавление виноградного сахара (1-2%), индиготина (0,5-1%), муравьинокислого натра (0,25-0,5%) необходимо для питания и размножения анаэробных бактерий, нуждающихся, как известно, в восстановляющих, легко отдающих свой кислород веществах. Прибавлением к агару глицерина (6-8%) получается плотная питательная среда, весьма пригодная для роста бугорчатой палочки. Агар с 1-2% виноградного сахара представляет лучший субстрат для испытания ферментативной способности бактерий: будучи засеян вызывающим брожение микроорганизмом, сахарный агар (при 37°) уже через 1-2 часа обнаруживает несколько пузырей газа, количество которых через сутки увеличивается настолько, что агар расщепляется на несколько отстоящих друг от друга на 1-3 см участков. Прекрасную питательную среду для роста многих патогенных бактерий, особенно различного рода вибрионов, представляет мясопептонный агар или желатина с прибавлением к ним алкалиальбумината, приготовляемого по способу Дейке: 3000,0 телятины дигерируются в течение суток с 1200 куб. см 3% раствора KHO; жидкость фильтруется и к прозрачному, окрашенному в темно-бурый цвет, фильтрату прибавляется соляная кислота до выпадения альбуминатов; последние отфильтровываются, размешиваются в небольшом количестве воды и подщелачиваются. Жидкость выпаривается, высушивается в порошок, который в количестве 2,5% прибавляется к мясопептонной желатине или агару. Алкалиальбуминат Дейке продается и в готовом виде. Из всех примесей к агару наибольшее значение имеет примесь крови; на такой среде Пфейферу удалось вырастить палочку инфлюэнцы. Берут из мякоти пальца, при обычных антисептических предосторожностях, несколько капель крови и размазывают их платиновой проволокой по поверхности косо застуженного агара; до употребления в дело пробирки ставятся на сутки в термостат (при 37°); пользуются лишь теми пробирками, которые после этой пробы не обнаружили никакого загрязнения. Как желатина, так и агар имеют свои достоинства и недостатки, и одна из этих сред не всегда может заменить другую. Агар употребляется главным образом для культивирования патогенных бактерий и вообще микроорганизмов, живущих при температуре тела (37°); желатиной, распускающейся уже при 25°, можно пользоваться, наоборот, лишь при комнатной температуре. На косо застывшем агаре в пробирках микроорганизмы сравнительно дольше сохраняют свою жизнеспособность, чем в желатине, так как вследствие выделения конденсационной воды собирающейся в нижней части пробирки агар в течение долгого времени предохранен от высыхания. Главный недостаток агара заключается в том, что, представляя собой тело, близко стоящее к углеводам, он не проявляет свойственной многим бактериям способности вырабатывать протеолитические, растворяющие белки ферменты; наоборот, желатина, как тело белковинное, пептонизируется и разжижается подобными бактериями, что имеет немаловажное значение для биологической их характеристики. Разжижение желатины некоторыми бактериями имеет и свои невыгодные стороны, препятствуя более или менее продолжительному наблюдению не разжижающих желатину бактерий, находящихся в исследуемом материале (воде, почве и т.п.) вместе с разжижающими микроорганизмами: последние заглушают собой рост первых. Вообще, при бактериологических исследованиях необходимо одновременно пользоваться обоими субстратами.

Весьма важную питательную среду для бактерий представляет кровяная сыворотка. Представляя собой прозрачный, плотный субстрат, приготовляемый из крови, она по составу своему лучше других сред удовлетворяет разнообразным требованиям, предъявляемым многими живущими в человеческом и животном организме болезнетворными микроорганизмами (палочкой дифтерита, туберкулеза и др.). Добывание крови для приготовления сыворотки и стерилизация последней связаны с немалыми затруднениями. Рациональнее всего пользоваться способом Ру и Нокорда, при котором в момент взятия крови исключается попадание зародышей из воздуха, чем устраняется необходимость стерилизации субстрата. В яремную вену животного вкалывается при соблюдении антисептических предосторожностей троакар; вынув из него иглу, вставляют стеклянную трубку, нижним своим концом переходящую через ватную пробку в узкий, высокий, тщательно обеспложенный цилиндр, собирающий кровь. Последняя оставляется в прохладном месте на 48 часов; отстоявшаяся за это время совершенно прозрачная, янтарно-желтого цвета сыворотка снимается обеспложенными пипетками в обеспложенные пробирки; последние кладут затем в особый термостат, дно которого слегка наклонено, и сыворотка без предварительной стерилизации подвергается здесь в косом положении свертыванию в течение 30-60 минут при 68°. Свертывание производится при косом положении пробирки с целью образования сывороткой по ее оплотнении широкой поверхности. Этот точный способ доступен лишь в лабораториях, имеющих в своем распоряжении какое-либо крупное животное (лучше всего лошадь), могущее дать время от времени большое количество крови (из 1-1,5 литров получается не больше 100-200 куб. см сыворотки). Обыкновенно приходится брать кровь на бойне и полученную через 2 дня сыворотку подвергать предварительно обеспложиванию по Тиндалю, нагреванием 8 дней подряд по 1 часу при 58°. Быстрое однократное обеспложивание сыворотки при высокой температуре невозможно: уже при темп., не превышающей 70°, она становится негодной, превращаясь в грязно-серую, мутную, непрозрачную массу. Если кровяная сыворотка не предназначена для немедленного употребления, то, по Кох-Кирхнеру, для ее стерилизации пользуются хлороформом, который, будучи прибавлен в количестве 1 куб. см на 100 куб. см сыворотки, в течение 2 месяцев вполне ее обеспложивает. Колбочки с содержимым во избежание испарения хлороформа тщательно закупориваются резиновыми пробками, которые заливаются парафином. В этом виде сыворотка сохраняется неограниченно долгое время. При необходимости пользования ею резиновые пробки заменяются обеспложенными ватными пробками, и колбочки ставятся на несколько дней в термостат для испарения хлороформа; сыворотка, разлитая затем в обеспложенные пробирки, подвергается обычным путем свертыванию. Баранья или телячья кровяная сыворотка, смешанная, по Лёффлеру, в отношении 3: 1 с телячьим бульоном, содержащим 1% пептона, 1% виноградного сахара и 0,5% поваренной соли, представляет лучшую питательную среду для дифтерийной палочки; размазав на поверхности этого субстрата подозрительную пленку, снятую с зева, можно в случае дифтерита уже нередко через 6 часов поставить диагностику, а следовательно, своевременно приступить к лечению противодифтерийной сывороткой. В некоторых специальных случаях, особенно для открытия гонококков, пользуются человеческой сывороткой, добывая кровь во время родов из последа. После перевязки и перерезки пуповины плацентарный ее конец, предварительно обмытый сулемой и стерилизованной водой, опускают в обезвоженную колбу, куда благодаря продолжающимся сокращениям матки выгоняется из пуповины небольшое количество крови. С целью воспользоваться кровяной сывороткой (которая, будучи раз свернута, более уже не разжижается) и для пластинчатых разводок, т.е. для изоляции бактерий, заражают жидкую обеспложенную, но несвернутую сыворотку прививным материалом и тщательно смешивают ее с 2% растопленным и остуженным до 42° С агаром; смесь разливается затем в чашки Петри, где она и застывает. 

Непрозрачные  питательные среды 
 
 
 
 
 
 
 

Из непрозрачных питательных сред первое место занимает картофель. Он служит прекрасным субстратом для многих сапрофитов и патогенных бактерий, обнаруживающих на нем характерный типический рост; им пользуются также для сохранения разводок на продолжительный срок и для обнаружения микроорганизмом спорообразования. Крупные, так называемые салатные картофелины очищаются под струей воды от грязи, после чего кончиком картофельного ножа вырезают все подозрительные места (глазки), разрезают картофель на круглые пластинки, кладут их в маленькие двойные чашки и обеспложивают в коховском аппарате. Рациональнее еще пользоваться для разводок на картофеле широкими, в 2,5 см в диаметре, пробирками. Пробочным сверлом вырезают из крупного картофеля цилиндр, разрезают его по диагонали на два клина и вкладывают каждый из них в пробирку широким концом вниз. Для предохранения разводки от загрязнения конденсационной водой, выделяющейся из картофеля, практично пользоваться пробирками, имеющими недалеко от дна кольцеобразное сужение, на котором и покоится картофельный клин, вода же собирается на дно пробирки, ниже сужения. Перед опусканием картофеля в пробирку наливают в последнюю несколько капель воды для предохранения субстрата от высыхания.

Для пигментных бактерий пользуются, по Сойка и  Кралю, питательной средой, приготовленной из разваренного в молоке риса: 100 г рисовой муки, тщательно растертой в ступке с 250 куб. см снятого молока, разваривают при постоянном помешивании в густую кашу и туго набивают последней цилиндрическую трубку. По охлаждении выдавливают рисовый цилиндр из трубки, разрезают его на несколько параллельных дисков, укладывают каждый из них в отдельную чашку, куда наливают еще несколько капель молока, и обеспложивают в течение 1/2 часа в коховском аппарате. На ярком фоне этой среды разноцветные пигментные бактерии выступают очень резко. 
 
 
 
 
 
 
 
 

Хлебная мезга, обладая кислой реакцией, служит хорошей средой для плесневых грибов. Насыпают в эрленмейеровские колбы обыкновенный черный хлеб, высушенный и растертый в мелкий порошок, прибавляют воды до получения однообразной влажной каши и обезвоживают в паровом котле. 
 

Заключение 

Дальнейшие успехи бактериологии и микробиологии  зависят главным образом от усовершенствования питательных сред в смысле приближения  их к условиям естественного питания  микроорганизмов. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы 

К. Френкель, "Основы учения о бактериях"

Актуальные вопросы  эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н.А. Семина. - М.: Медицина, 1999

Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.

Санитарная микробиология  и вирусология. / З.Н. Качемасова, С.А. Ефремова, А.М. Рыбакова - М.: Медицина, 1987.

Егоров Н.С. Практикум  по микробиологии. М 1976