Фармакогностический анализ лекарственного растительного сырья, обладающее противоопухолевой активностью

 

Табл. 5 – Хроматографический анализ осадка №2, №3

 

В результате хроматографического анализа осадков №2, №3 можно сделать вывод о том, что осадках №2, №3 обнаружены фенолокислота, терпеновые соединения, а именно лупеол, бетулин, бетулиновая кислота.

Исследование осадка №4

При хроматографическом анализе осадка №4 определяем два пятна. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в табл. 3.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №4 содержится фенолокислота с Rf1=0.71 и Rf2=0.80, так как пятна в системах 1 и 2 флюоресцировали голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявлялись синим цветом.

Оставшееся одно пятно можно отнести к терпеновым соединениям. Идентификацию проводили при «свидетелях» – бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятно 1 оказалось идентично бетулину с Rf1=0.39 и Rf2=0.57.

 

№ пятна	Система 1				№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.39	-	-	син	1	0.57	-	-	син
2	0.71	-	гол	син	2	0.80	-	гол	син

 

Табл. 6 – Хроматографический анализ осадка №4

 

В результате хроматографического анализа осадка №4 были идентифицированы следующие классы соединений: фенолокислота, терпеновое соединение идентифицировано как бетулин.

Исследование осадка №5

При хроматографическом анализе осадка №5 определяем одно пятно.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №5 содержится фенолокислота, так как пятно с Rf1=0.79 и Rf2=0.85 флюоресцирует голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом.

 

№ пятна	Система 1				№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК
1	0.79	-	гол	син	1	0.85	-	гол	син

 

Табл. 7 – Хроматографический анализ осадка №5

 

 

 

 

Рис. 9 – Осадок № 5 в различных системах растворителей

 а – хроматограмма в системе 1; б – хроматограмма в системе 2.

 

В результате хроматографического анализа видим, что осадок № 5 является индивидуальным веществом, в УФ - свете флюоресцирует голубым цветом. Предполагаем, что осадок № 5 является фенолокислотой.

Осадок № 5 представляет собой белые кристаллы, с Тплав=210-212 °С, растворимые в этаноле (Рис.10).

 

Рис. 10 – Кристалл осадка № 5

 

Хроматографический анализ осадка № 5 в выше приведенных системах (№ 4 и 5) также потверждают индивидуальность соединения.

Пятно в системе 4 имеет Rf=0.93, в системе 5 имеет Rf=0.30.

 

Рис. 11 – Хроматограммы осадка № 5 в различных системах растворителей:

а – Осадок № 5 в системе растворителей 4; б – Осадок № 5 в системе растворителей 5.

 

Для проявления хроматограмм использовали следующие качественные реакции на фенолокислоты [28]:

Реакция азосочетания, приводящая к образованию окрашенных соединений с диазотированным п-нитроанилином: 25 мл 0,3 % раствора п-нитроанилина в 8 % НCl смешиваем непосредственно перед употреблением с 1,5 мл 5 % водного раствора NaNO2 и полученной смесью обрабатываем хроматограммы. Через несколько минут хроматограмму дополнительно опрыскивают 20 % водным раствором Na2CO3.

По литературным данным известно, что п-оксибензойная кислота дает бледно-желтую окраску, переходящую в розовую после опрыскивания раствором карбоната натрия.

Ванилиновая кислота дает желтую окраску, переходящую в фиолетовую, протокатеховая и галловая – желтую окраску, переходящую соответственно в серовато-синию и светло-коричневую, п-кумаровая – желтую окраску, переходящую в синию.

Осадок № 5 дает желтую окраску, переходящую в синию. Исходя их этого предполагаем п-кумаровую кислоту.

Образование комплекса с 1% раствором железоаммониевых квасцов FeNH4(SO4)2 ·12H2O в воде [16].

Фенолы, имеющие орто- диоксигруппы, окрашиваются в зеленый, а три рядовые оксигруппы в синий цвет.

Осадок № 5 с раствором железоаммониевых квасцов не изменяет свою окраску, что подтверждает наличие лишь одной фенольной группы.

При вычислении Rf кислот и сравнение с литературными данными было доказано наличие п-кумаровой кислоты.

 

 

 

 

 

 

№	Кислоты	Rf фенолокислот (литературные данные)		Кач. реакции фенолокислот
		Система 4	Система 5	УФ	ДзПНА	ЖАК
1	п-окибензойная	0.87	0.28	-	роз.	-
2	ванилиновая	0.89	0.40	-	фиолет.	-
3	протокатеховая	0.83	0.05	тем	сер-син	зел.
4	галловая	0.60	0.00	т.ф	св-кор	син.
5	п-кумаровая	0.93	0.30	син	син	-
Результаты исследуемого осадка №5
1	Осадок №5	0.93	0.30	син.	син.	-

 

Табл. 8 – Хроматографический анализ фенолокислот в различных системах растворителей

 

Таким образом, осадок №5 идентифицирован как фенолокислота - п-кумаровая.

Данная кислота была выделена как индивидуальное вещество (Рис.10). Были определены физико-химические параметры (Тплав=210-212°С, что соответствует литературным данным п-кумаровой кислоты).

 

 

Рис. 12 – п-кумаровая кислота

ИК-спектр ν см-1 (таблетка КВr): 3395 см-1 (валентные колебания ОН-группы); 2930 см-1 (углеродный скелет ароматического кольца); 1700 см-1 (валентные колебания С=О в карбонильной группе); 1650 см-1 (парадизамещенные в бензойное кольцо); 1450 см-1 (колебания ОН-группы в кислотах); 1390 см-1 (колебания ОН-группы в фенолах); 1040 см-1 (колебания СН-связи).

Физические характеристики подтверждают предположения о том, что осадок № 5 представлен в виде п-кумаровой кислоты.

Таким образом, в гексановой фракции выделена и идентифицирована п-кумаровая кислота, содержание, которой от воздушно-сухого сырья составляет 0.02 %. Кроме того, идентифицироаны терпеновые соединения, а именно бетулиновая кислота, бетулин и лупеол.

Исследование надосадочной жидкости гексанового экстракта

Полученный гексановый экстракт упариваем, получаем раствор слабо-желтого цвета. Раствор сушим при нормальных условиях, получаем белый осадок с желтым маслообразным вкраплением, которое отмываем петролейным эфиром. Петролейный экстракт упариваем, получаем желтую маслообразную жидкость с массой 0.02г [25].

Хроматографирование полученной маслообразной жидкости в системе растворителей гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота (73:25:2), характерная для анализа липидов.

На хроматограмме наблюдаем наличие размытого, характерного для высших жирных кислот, пятна с Rf от 0.46 до 0.58, с голубым свечением. Из этого можно сделать вывод о наличии высших жирных кислот в маслообразной жидкости из гексанового экстракта.

После того как отделили белый осадок от желтой маслянистой жидкости, проводим хроматографический анализ осадка. Осадок растворяем в этиловом спирте, хроматографируем в системе растворителей: хлороформ – бензол – этилацетат (4:8:1). Полученную хроматограмму просматриваем в видимом и УФ-свете, проявляем ФМК.

При хроматографическом анализе осадка выделены пять пятен. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в табл. 9.

 

№ пятна	Rf пятна	Проявитель
		Видимый свет	УФ	Пары NH3	5% спирт. р-р AlCl3	5% водн. р-р Na2CO3	ФМК
1	0.00	жел	жел	жел	жел	жел	син
2	0.20	св-жел	св-жел	яр. жел	жел	св-жел	син
3	0.40	-	-	-	-	-	син
4	0.57	-	-	-	-	-	син
5	0.73	-	гол	-	гол	гол	син

 

Табл. 9 – Хроматографический анализ осадка гексанового экстракта

 

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке обнаружена фенолокислота, так как пятое пятно флюоресцирует голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляется синим цветом. Два пятна можно отнести к терпеновым соединениям. Идентификацию проводили при «свидетелях» – бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Третье и четвертое пятна оказались идентичны бетулину (Rf=0.40) и лупеолу (Rf=0.57) соответственно. Второе пятно представлено в виде флавоноида, а именно флавонолы. Для подтверждения проводили качественные реакции на флавоноиды, для этого использовали пары аммиака (NH3), 5 % водный раствор соды (Na2CO3), 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия (AlCl3).

При проведении цветных реакций выявили соответствие второго пятна флавонолу, так как реакция на 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия дает желтое окрашивание, 5 % водный раствор соды давал светло-желтое окрашивание, а пары аммиака – ярко-желтое окрашивание. Первое пятно не идентифицировано.

В результате хроматографического анализа надосадочной жидкости можно сделать вывод о том, что в надосадочной жидкости находятся фенолокислоты, терпеновые соединения (бетулин, лупеол) и флавоноиды (флавонолы).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

По результатам проделанной работы сделаны следующие выводы:

1. Рассмотрели конкретные виды лекарственного растительного сырья, обладающее противоопухолевой активностью, а именно: лопух большой, чага.
2. Ознакомились с ботаническим описанием, заготовкой, фармакологическими действиями лопуха большого и чаги.
3. Проведен литературный анализ химического состава березового гриба (чаги) выявил следующие биологически активные классы соединений: органические кислоты (щавелевая, муравьиная, уксусная, масляная, ванилиновая, п-оксибензойная кислоты, обликвиновая, инонотовая, агарициновая, гуминоподобная чаговая кислота), аминокислоты, витамин В1;
4. Определены фармакопейные показатели (влажность 12.9 %, зольность 8.6 %, экстрактивные вещества 21.9 %, хромогенный комплекс 39.0 %) заготовленного сырья, значение которых соответствуют требованиям Государственной фармакопеи. По полученным данным была проведена статистическая обработка;
5. Разработана схема последовательного извлечения веществ согласно их полярности, в результате выделена фракция тритерпеновых соединений. На основании проведенных испытаний был предложен проект экспертизы природного сырья методом дегирирования (кипячение с обратным холодильником), выход фракции составил 0.5 % от воздушно-сухого сырья;