Фармакогностический анализ лекарственного растительного сырья, обладающее противоопухолевой активностью

где m1  -  масса  сухого  остатка  до осаждения хлористоводородной кислотой в граммах;  m2 - масса  сухого  остатка  после  осаждения хлористоводородной кислотой в граммах; 

m - масса сырья в граммах;

W - потеря в массе при высушивании  сырья в процентах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Результаты собственного исследования.

Чага широко используется в народной медицине. Для приготовления настоек из чаги чаще всего используется в качестве растворителя этиловый спирт. Поэтому для исследования лекарственных свойств спиртовых экстрактов производим их наработку.

Выделение и идентификация флавоноидов чаги

Березовый гриб – чагу измельчали до мелкодисперсного состояния при помощи электрического измельчителя (РМ-120). Измельченной чагой в виде порошка заполняли изготовленный из фильтровальной бумаги патрон (mпатрона=3.82г, mпатрона+чага=43.54г, mчаги=39.72г). Затем патрон помещали в аппарат Сокслета (Рис. 7) и проводили экстракцию спиртом до полного извлечения всех экстрактивных веществ, растворимых в спирте.

В качестве растворителей использовали этиловый спирт. Экстракцию прекращали, когда растворитель в аппарате Сокслета прекращал окрашиваться и оставался бесцветным. Полученный после экстракции раствор (экстракт) изучали с помощью тонкослойной хроматографии с применением цветных реакций.

 

Рис. 7 - Аппарат Сокслета

1-экстрагируемое вещество; 2-пористая  гильза; 3-трубка сифона; 4-растворитель

Для этого на пластинки «Silufol» наносили анализируемые экстракты. Путем предварительного подбора выявляли наиболее подходящую систему растворителе для хроматографирования флавоноидов.

Для этого использовали следующие системы растворителей:

1. н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5);
2. бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10);
3. хлороформ - бензол – этилацетат (4:8:1).

Анализ хроматограмм в различных системах растворителей показало следующее:

1. в первой системе флавоноиды проявились в виде одного пятна с Rf=0,71, но не проявились другие индивидуальные компоненты (Рисунок 2.7,а);
2. во второй системе наблюдается частичное разделение флавоноидов, но пятна имеют достаточно низкий Rf до 0,1. Однако в данной хроматограмме можно наблюдать другие индивидуальные компоненты такие как фенолокислоты, стерины, терпеновые соединения (Рис. 8);
3. третья система часто применяется для терпеновых соединений, хорошо показала разделение фенолокислот кислот от терпеновых соединений. Однако флавоноиды также остались на старте (Рис. 8 ).

 

Рис. 8 – Спиртовый экстракт чаги в различных системах растворителей

 

Следовательно, наиболее подходящая система растворителей для хроматографирования флавоноидов является система: н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5)

Реактив	Источник света	Окраска пятен
		Флавонолы	Флавононы	Халконы	Изофлавоны
	Видимый	бл-жел	-	жел	-
	УФ-свет	корич	-	жел-зел	корич
Пары NH3	УФ-свет	яр-зел	бл-жел	красная	тем
5% р-р Na2CO3	Видимый	жел	жел-зел	красная	бл-жел
5% р-р АlCl3	УФ-свет	жел-зел	-	жел	корич

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Табл. 1 – Качественные реакции на флавоноиды

 

 

После хроматографирования спиртового извлечения в различных системах растворителей и обработки хроматограмм специфическими проявителями пришли к выводу, что в спиртовом экстракте чаги содержится представители следующих классов: флавоноиды (халконы), терпеновые соединения, фенолокислота, стерины.

 

 

 

 

Комплексное исследование химического состава березового гриба – чаги

 

По литературным данным березовый гриб – чага содержит большое количество соединений, принадлежащих к различным классам биологически активных соединений, что требует дальнейшего их изучение и идентификации.

Для этого последовательно экстрагируем сырье растворителями с повышающимся градиентом полярности (гексан, толуол, этилацетат) в аппарате Сокслета с целью разделения биологически активных комплексов по полярности.

Березовый гриб - чагу измельчаем до мелкодисперсного состояния при помощи электрического измельчителя (РМ-120). Измельченной чагой в виде порошка заполняли изготовленный из фильтровальной бумаги патрон. Затем патрон помещали в аппарат Сокслета и проводим последовательно экстракцию гексаном, толуолом, этилацетатом до полного извлечения всех экстрактивных веществ, которые растворимы в гексане, толуоле, этилацетате. Экстракцию прекращали, когда растворитель в аппарате Сокслета прекращал окрашиваться, и оставался бесцветным.

Исследование гексановой фракции чаги

Согласно схеме проводим последовательную экстракцию в аппарате Сокслета.

Первоначально проводим экстракцию гексаном при температуре 78°С (Ткип растворителя) до полного извлечения всех экстрактивных веществ, растворимых в гексане.

Полученный гексановый экстракт упариваем до 10 мл, охлаждаем и наблюдаем выпадение осадка №1. Надосадочную жидкость сливаем и оставляем испарятся при нормальных условиях. В результате чего после 1 часа испарения также наблюдаем выпадение осадка №2 в надосадочной жидкости. Операцию повторяем, в результате чего получаем пять осадков

 

 

 

 

 

 

Табл. 2 – Схема последовательной экстракции чаги растворителями с повышающимся градиентом полярности

 

 

 

№ осадка	Масса гексанового осадка, г	Процентный выход, %
1	0.09	0.20
2	0.06	0.13
3	0.05	0.11
4	0.03	0.07
5	0.01	0.02
Σ	0.24	0.53

 

Табл. 3 – Выход осадков гексановой фракции

 

 

Исследование осадков гексановой фракции

Полученные осадки перекристаллизовываем этиловым спиртом и проводим хроматографический анализ полученных осадков с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol».

Использовали следующие системы растворителей:

1. хлороформ - бензол - этилацетат (4:8:1);
2. бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10).

Полученные хроматограммы просушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ - свете, проявляем ФМК.

Исследование осадка №1

При хроматографическом анализе осадка №1 определяем три пятна.

Распределение пятен в различных системах растворителей показано в табл.2

 

 

№ пятна	Система 1				№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.39	-	-	син	1	0.41	-	-	син
2	0.52	-	-	син	2	0.59	-	-	син
3	0.61	-	гол	син	3	0.72	-	гол	син

 

Табл. 4 – Хроматографический анализ осадка №1

 

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №1 содержится фенолокислота, так как по литературным данным известно, что фенолокислоты флюоресцируют голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом. Оставшиеся два пятна можно отнести к терпеновым соединениям, так как терпеновые соединения не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание. Идентификацию проводили при «свидетелях» – бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 1 и 2 оказались идентичны бетулину

(Rf1=0.39; Rf2=0.41) и лупеолу (Rf1=0.52; Rf2=0.59).

В результате хроматографического анализа осадка № 1 можно сделать вывод о том, что осадок №1 содержит фенолокислоту, терпеновые соединения, а именно бетулин и лупеол.

Исследование осадков №2, №3

Хроматографический анализе осадков №2, №3 выявил их идентичность. На хроматограмме выделены четыре пятна. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в табл. 2 .

В обеих системах наблюдаем флюоресценцию голубым цветом пятна с Rf1=0.73 и Rf2=0.78, которые при опрыскивании ФМК дают синее окрашивание, что предполагаем наличие фенолокислот.

Идентификацию проводили при «свидетелях» – бетулине, бетулиновой кислоте и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 1, 2, 3 оказались идентичны бетулиновой кислоте (Rf1=0.17; Rf2=0.23), бетулину (Rf1=0.38; Rf2=0.47) и лупеолу (Rf1=0.52; Rf2=0.63).

Отличие фракции 2 и 3 заключается в том что, бетулиновая кислота в осадке №2 находится в большей концентрации, чем в осадке №3.

 

№ пятна	Система 1				№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.17	-	-	син	1	0.23	-	-	син
2	0.38	-	-	син	2	0.47	-	-	син
3	0.52	-	-	син	3	0.63	-	-	син
4	0.73	-	гол	син	4	0.78	-	гол	син