Онковирусы. Механизмы трансформации клеток

ультрафиолета или другие типы воздействия, эффективные при индукции образования фага лизогенными бактериями, не привели к образованию вируса. Однако, когда к таким не продуцирующим вирус культурам добавляли небольшое количество РАВ, наблюдалась неожиданная вспышка синтеза как РАВ, так и ВСР. Подобным образом вел себя любой из клонов трансформированных клеток, не продуцировавших вирус. Было обнаружено, что образование ВСР индуцирует не только РАВ, но и многие другие родственные штаммы вирусов, вызывающих лейкозы, в том числе и исходный вирус ФИР.

РАВ и ФИР, обладая некоторым серологическим родством, тем не менее серологически отличаются друг от друга. Вирионы же ВСР, образующиеся под влиянием одного из этих вирусов, иммунологически идентичны индуцирующему вирусу. Таким образом, резюмируя сказанное выше, можно прийти к выводу, что вирус саркомы Рауса является дефектным вирусом, неспособным индуцировать образование какого-то компонента, входящего в состав вириона. Поэтому зрелый ВСР может образоваться лишь в том случае, если этот компонент будет синтезирован либо РАВ, либо ФИР. Вновь синтезировавшийся зрелый ВСР по антигенной структуре будет походить на вирус, индуцировавший синтез недостающего компонента его вириона.

Следовательно, каждая трансформированная клетка содержит геном ВСР, однако в отсутствие вируса-помощника информация, содержащаяся в этом геноме, для образования вируса не используется. Однако в том случае, когда зрелый ВСР уже образовался, он может трансформировать клетку, не прибегая к содействию вируса-помощника. У животных, не зараженных РАВ, вирус саркомы Рауса индуцирует образование опухолей, состоящих из клеток, не продуцирующих вирус, причем в организме этих животных антитела, нейтрализующие ВСР, не образуются.

Резюмируя, мы можем прийти к выводу, что образование у животных опухолей, не продуцирующих вирус, можно объяснить двумя причинами. С одной стороны, у животных, зараженных ВСР и РАВ, иммунологическая реакция со стороны организма может привести к тому, что опухоль, индуцированная ВСР, не будет содержать вируса вследствие уменьшения количества свободного РАВ. С другой стороны, как и в опыте in vitro, опухоль, состоящая из клеток, не продуцирующих вирус, может возникнуть вследствие того, что клетка-родоначальница опухоли была трансформирована ВСР при отсутствии в ней вириона РАВ.

События, происходящие на молекулярном уровне, при трансформации клетки вирусом саркомы Рауса

Эксперименты, описанные в предыдущем разделе, выявили два важных события, происходящих при трансформации клеток вирусом саркомы Рауса, которые требуют объяснения на молекулярном уровне. Эти события таковы: 1) интеграция вирусного генома с клеткой-хозяином, претерпевшей трансформацию, которая происходит таким образом, что вирусный геном сохраняется во всех генерациях трансформированных клеток, и 2) воздействие, оказываемое вирусом на клетку, результатом которого является трансформация свойств клетки.

В настоящее время ясно, что материалом, использовавшимся исследователями, пытавшимися прежде определить состав и свойства вируса саркомы Рауса, служил не чистый вирус Рауса, а его смесь с вирусом-помощником, содержание которого в этой смеси превалировало. Анализ показал, что единственной нуклеиновой кислотой, содержащейся в таких смесях ВСР и РАВ, является РНК. Было установлено, что молекулярный вес этой РНК необычайно велик -- около 107 дальтон, что примерно в пять раз превышает молекулярный вес РНК вируса полиомиелита. Данные, полученные при изучении влияния на размножение вируса саркомы Рауса различных ингибиторов синтеза ДНК, а именно 5-фтордезоксиуридина, аминоптерина и цитозинарабинозида, показали, что добавление этих ингибиторов к зараженным клеткам после начала образования ВСР не прерывает его дальнейшего синтеза, и, таким образом, подтвердили, что в состав ВСР действительно входит только РНК.

Оказалось, однако, что, несмотря на то что уже начавшийся синтез вируса Рауса действительно продолжается при ингибировании синтеза ДНК, синтез ДНК является необходимым условием самого обоснования

этого вируса в клетке. Так, например, было показано, что облучение клеток с равной эффективностью блокирует как рост клеток, так и их трансформацию ВСР, а ингибирование синтеза ДНК эффективно подавляет как инициирование трансформации клеток ВСР, так и инициирование образования самого ВСР. Дальнейшие эксперименты показали, что период, в течение которого синтез ДНК необходим для последующего развития процессов, индуцируемых ВСР, заканчивается примерно через 5 час после заражения клеток вирусом. Интересно, что, несмотря на то что образование вируса не начинается раньше чем через 15 часов после заражения клетки, процессы, идущие по окончании 5 час после заражения вирусом, не прерываются при подавлении синтеза ДНК. Для объяснения этих результатов Темин предложил следующую схему синтеза ВСР. Согласно этой схеме, геном вируса саркомы Рауса, т. е. его РНК, служит матрицей для образования комплементарной ей двухспиральной ДНК-реплики (провирусной ДНК), в свою очередь интегрирующейся с ДНК клетки. Вновь образующаяся вирусная РНК транскрибируется с интегрированной клеточной вирусоподобной ДНК. Эта схема объясняет еще одно неожиданное наблюдение, а именно ингибирование уже начавшегося синтеза ВСР актиномицином антибиотиком, как известно, подавляющим синтез РНК на ДНК-матрице.

Хотя эта схема и противоречит ортодоксальным представлениям, она тем не менее стимулирует дальнейшее изучение этой проблемы. Следует, однако, подчеркнуть, что результаты, полученные при изучении влияния ингибиторов на взаимодействие ВСР с клеткой, можно объяснить и другим образом. Например, известно, что хотя актиномицин практически не подавляет размножения ряда РНК-содержащих вирусов, на синтез вируса ньюкаслской болезни он оказывает такое действие. В вирионе этого вируса содержится примерно столько же РНК, сколько и в вирионах ВСР -- РАВ. Однако этот вирус размножается в цитоплазме и поэтому ни в коей мере не зависит от клеточной ДНК. Следовательно, за ингибирование действия ВСР актиномицином может быть ответственно не блокирование синтеза РНК на ДНК-матрице, а какой-то иной эффект, оказываемый этим антибиотиком. 

7. ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ДНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ И ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ИНТЕГРАЦИИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА 

При изучении действия вирусов на культуры клеток был обнаружен еще один вид индуцируемой вирусами трансформации клеток -- конверсия фибробластов эмбрионов млекопитающих в опухолевые клетки, вызываемая вирусом полиомы, вирусом 5У-40 и аденовирусами. Из представителей этой группы трансформирующая активность была обнаружена сначала у вируса полиомы -- вируса, впервые выделенного из опухоли слюнной железы мыши. Этот вирус обладает удивительным свойством: он вызывает образование опухолей самых различных органов, причем не только у мышей, но и у хомяков и у иных животных. Примечательно, что подобным широким спектром действия обладают также и клоны, выделенные из отдельных бляшек. Способность вируса полиомы индуцировать трансформацию клеток культуры ткани впервые была обнаружена Фогт и Дульбекко. Затем Шейн и Эндерс показали, что вирус 5У-40 способен трансформировать клетки эмбриона человека, а Трентин обнаружил способность аденовирусов вызывать образование опухолей у хомяков.

При воздействии этих вирусов на первичные эмбриональные клетки трансформируется менее 1% клеток, подвергшихся заражению. В этом отношении эти вирусы резко отличаются от вируса саркомы Рауса, способного трансформировать до 20--40% эмбриональных клеток культуры. Вначале трансформацию клеток вирусом полиомы удавалось наблюдать лишь в массе культивировавшихся клеток, причем не ранее чем через 10 дней после заражения, когда разросшаяся зона трансформированных клеток становилась легко видимой. Недавно было показано, что уже установившиеся культуры нормальных клеток трансформируются вирусами полиомы и 5У-40 в опухолевые с частотой, варьирующей от 1 : 2 до  1 : 10.

Частота трансформации может быть определена непосредственно путем количественного анализа клонов клеток, растущих в культуральной среде, содержащей агар. Нормальные фибробласты не в состоянии расти в такой среде, тогда как большинство трансформированных клеток обладает таким свойством.

После того как было установлено, что трансформация клеток вирусом полиомы является четким, хорошо воспроизводимым явлением, были предприняты попытки определить, сохраняется ли вирус в трансформированных клетках. Очевидно, можно представить себе две возможности: 1) клетка может сохранять состояние трансформации лишь в том случае, если гены вируса интегрированы с геномом клетки; 2) роль вируса сводится к инициации у клетки каких-то изменений, передающихся затем клеткам всех последующих генераций, однако дальнейшее присутствие вируса в клетке для поддержания состояния трансформации не обязательно. Анализ многих клонов трансформированных клеток, при получении которых в культуральную среду добавляли антивирусную сыворотку, показал, что большинство, если не все клональные линии трансформированных клеток, не содержат цельного инфекционного вируса. Более того, все попытки обнаружить в этих линиях трансформированных, не содержащих инфекционного вируса клеток, инфекционную вирусную ДНК, антигены, сходные с белками капсида, а также все попытки реактивировать вирусные гены путем заражения трансформированных клеток родственными мутантными вирусами (метод демаскировки гена) оказались совершенно безуспешными.

Однако в то же время с помощью иных иммунологических методов были получены данные, позволяющие предполагать, что в трансформированных вирусом полиомы клетках содержится и функционирует по крайней мере часть генома вируса. Эти исследования показали, что в таких клетках содержится чужеродный антиген, отличающийся от анти-тенов капсида вируса и ответственный за отторжение этих клеток организмом иммунологически компетентного животного. Еще более важным оказалось то, что все опухоли, индуцированные вирусом полиомы, по-видимому, содержат одинаковый вируеоепецифичный антиген. Наиболее вероятная интерпретация этих результатов состоит в том, что в таких клетках содержится геном вируса, который и ответствен за образование трансплантационного антигена.

Данные, полученные впоследствии при изучении клеток, трансформированных другими ДНК-содержащими вирусами, убедительно показали, что вышеизложенная интерпретация правильна. Так, было обнаружено, что в сыворотке крови животных, являющихся носителями свободных от вируса опухолей, индуцированных аденовирусами типа 12 и 18, содержатся комплемент связывающие антитела против антигенов, содержащихся в экстрактах культивируемых клеток, продуцирующих эти вирусы. Более того, эти антитела обладали соответствующей типовой специфичностью, т. е. у животных, в организме которых имелась опухоль, индуцированная аденовирусом типа 12, в сыворотке крови имелись и антитела против антигенов аденовируса типа 12, а не типа 18, и наоборот. Дальнейшие эксперименты показали, что в сыворотке крови хомяков, в организме которых имеются опухоли, индуцированные аденовирусом, содержатся антитела к той части капсида аденовируса, которая определяет типовую специфичность вируса. Эти данные свидетельствуют о несомненном наличии по крайней мере части генома вируса в не содержащих инфекционного вируса опухолях.

Дополнительные доказательства справедливости изложенной выше точки зрения были получены при изучении клеток, трансформированных вирусом 5У-40. Оказалось, что в этих клетках содержится опухолевый антиген, названный Т-антигеном, который отличается от антигенов капсида вируса. Т-антиген был обнаружен также в клетках, зараженных вирусом 5У-40, которые продуцируют инфекционный вирус и реагируют на заражение цитопэтической реакцией. В таких клетках Т-антиген появлялся за много часов до появления антигенов капсида вириона. Более того, в случае когда к зараженным клеткам с целью предотвращения синтеза вирусной ДНК добавляли фтордезоксиуридин или цитозинарабинозид, синтеза антигена капсида вируса не наблюдали никогда, тогда как опухолевый антиген синтезировался как обычно. Поэтому представляется вполне вероятным, что по крайней мере те гены вируса, которые детерминируют образование антигена этого типа, действительно включаются (интегрируются) в геном клетки.

Весьма противоречивы мнения о том, сколь велика часть генома вируса, включающаяся в геном клетки. Изучение относительной чувствительности к облучению цитопатической активности вируса полиомы (т. е. способности образовывать бляшки) и его трансформирующей активности показало, что при увеличении дозы ультрафиолета вирус сначала теряет способность образовывать бляшки и лишь при дальнейшем-воздействии оказывается неспособным трансформировать клетки. Эти данные согласуются с представлением, согласно которому для осуществления трансформации необходимо сохранение целостности, а возможно, и интеграции с геномом клетки лишь части генома вируса.

С другой стороны, были опубликованы данные, согласно которым линии клетки, трансформированные вирусом 5У-40, спорадически образуют зрелый инфекционный вирус. Однако такой способностью обладают далеко не все клетки, трансформированные вирусом. Действительно, как было показано впоследствии, большинство линий клеток, трансформированных вирусом 5У-40 и выделенных в виде отдельных клонов из культур, росших на культуральных средах, которые содержали антивирусную сыворотку, по-видимому, никогда не образуют полного вируса. Было, однако, обнаружено, что если эти клетки смешать с клетками почек африканских зеленых мартышек, то в такой культуре индуцируется образование вируса 5У-40. Кроме того, было показано, что некоторые вирусные частицы, по своему генотипу являющиеся вирусом 5У-40, могут размножаться лишь в том случае, когда в культуре одновременно содержится аденовирус. Однако образующиеся при их размножении вирионы обладают капсидом аденовируса. Поэтому возможно, что за наблюдаемое иногда образование вируса 5У-40 трансформированными клетками ответствен вирус-помощник.

Недавно было показано, что быстро метящаяся РНК (по-видимому,, информационная РНК), выделенная из клеток, трансформированных вирусом полиомы, специфически гибридизуется с ДНК вируса полиомы. Эти данные также свидетельствуют в пользу того, что в трансформированных клетках действительно содержится вирусная ДНК, причем, вероятнее всего, включенная в геном клетки. В клетках, трансформированных аденовирусом, эта вирусоспецифичная РНК концентрируется главным образом в полисомах. Этого и следует ожидать в случае, если часть содержащегося в трансформированной клетке вирусного генома активно функционирует. Таким образом, весьма вероятно, что в большинстве клеточных линий, трансформированных мелкими ДНК-содержащими вирусами, действительно содержатся гены вируса, которые, по-видимому, функционируют и продуцируют вирусо специфичные молекулы РНК и вирусо специфичные антигены.