Онковирусы. Механизмы трансформации клеток

Прежде чем приступить к рассмотрению роли вирусов в образовании опухолей, имеет смысл сначала кратко описать ряд опухолей вирусного происхождения, встречающихся в природе или образующихся в экспериментах на животных. Опухолеродные вирусы вызывают широко распространенные в природе заболевания, например лейкозы птиц, лейкемию и рак молочной железы мышей, папилломы и фибромы различных млекопитающих, а также бородавки человека (доброкачественная опухоль). Ряд же других опухолеродных вирусов вызывает в естественных условиях заболевания лишь изредка. Например, вирус полиомы мышей, хотя и широко распространен в природе, в естественных условиях редко вызывает образование неоплазм. Следует, однако, отметить, что впервые он был выделен именно из такой опухоли. Однако этот вирус регулярно вызывает трансформацию культивируемых клеток, в связи с чем широко используется при экспериментальных исследованиях.

Способностью трансформировать клетки в культуре обладают и другие вирусы однако до сих пор не было обнаружено, чтобы они вызывали опухоли в естественных условиях. В качестве примера такого типа вирусов можно привести вирус 5У-40, впервые выделенный из первичной культуры клеток почек обезьян, и аденовирусы человека. Оба эти агента обладают способностью вызывать малигнизацию клеток хомяка, как в культуре, так и при введении вируса животному. Вирус 5У-40 способен также трансформировать культивируемые in vitro клетки человека. Однако ни в отношении вируса 5У-40, ни в отношении аденовирусов не было показано, что они вызывают опухоли у своих естественных хозяев, т. е. соответственно у обезьян и человека.

Поскольку объем этой книги не позволяет подробно изложить историю открытия всех до сих пор обнаруженных опухолеродных вирусов, мы вынуждены ограничиться упоминанием лишь наиболее выдающихся открытий.

Впервые осуществить успешную перевивку опухоли от одного животного другому путем введения сыворотки или бесклеточного экстракта удалось Эллерману и Бангу. Эти авторы показали, что для пассирования висцерального лимфоматоза кур от одного животного к другому не обязательно вводить реципиенту интактные клетки донора. Однако в то время не было известно, что это сложное заболевание по своему характеру близко злокачественной опухоли кроветворной системы млекопитающих. Действительным же началом развития отрасли науки, называемой теперь вирусологией опухолей, послужила работа Пейтона Рауса, в которой он показал, что «естественная» саркома кур породы плимутрок может быть пассирована от одного животного к другому путем инокуляции бесклеточного, не содержащего бактерий фильтрата опухоли.

В течение многих лёт сама возможность существования опухолеродных вирусов казалась сомнительной. Объяснялось это главным образом отсутствием понимания общей природы вирусов, а также тем, что многие экспериментаторы-патологи совершенно не считались с данными, полученными на каких-либо других объектах, помимо млекопитающих. Новым стимулом к изучению опухолеродных вирусов послужили исследования, начатые в 1932 г. Шоупом и его сотрудниками, избравшими в качестве объекта изучения вирус, вызывающий папиллому у кроликов. Этот вирус можно легко выделить из папиллом, как возникших, так и индуцированных в естественных условиях, у диких америкячских кроликов, однако следует отметить, что лишь изредка эти опухоли превращаются у них в злокачественные.

Когда же этим вирусом заразили домашних кроликов (эти животные относятся к другому роду), были обнаружены два поразительных факта. Так, оказалось, что, во-первых, индуцировавшиеся у домашних кроликов папилломы систематически превращались в злокачественные карциномы и, во-вторых, инфекционный вирус, который можно было выделить из папиллом диких кроликов без особых трудностей, из опухолей домашних кроликов удавалось выделить очень редко, хотя его присутствие можно было обнаружить, используя чувствительные антигенные тесты. Эти исследования дали толчок к изучению роли «маскированных» вирусов в образовании опухолей («маскированными» называют вирусы, не обнаруживаемые методами, основанными на выявлении инфекционное).

В 1936 г. Биттнер открыл еще один важный опухолеродный вирус. Этот исследователь показал, что рак молочной железы возникает у тех мышей, которые были вскормлены молоком, содержащим особый фактор (так называемый фактор молока). Впоследствии было показано, что этот фактор обладает свойствами, характерными для вируса, а именно проходит через бактериальные фильтры и стимулирует образование антител. На электронных микрофотографиях зараженных вирусом опухолевых клеток, культивировавшихся in vitro, можно было ясно обнаружить наличие в них вирусных частиц. Тем не менее до сих пор не удалось адаптировать этот вирус к тканевым культурам, что не позволяет осуществить его количественное изучение.

Одно интересное свойство этой системы, в особенности привлекательное для экспериментаторов, состоит в том, что рак молочной железы возникает лишь у тех зараженных этим вирусом самок мышей, молочная железа которых подвергается воздействию соответствующих гормонов, либо введенных искусственно, либо поступающих в кровоток при беременности. Эти данные вновь продемонстрировали, что опухолеродный вирусам свойственно находиться в латентном, или маскированном, состоянии. Очень важно, что эти эксперименты обратили также внимание исследователей на тот факт, что для образования вирусом опухоли необходимо какое-то вторичное событие, в данном случае гормональный стимул.

Работы Рауса, Шоупа и Биттнера стимулировали поиск опухолеродных вирусов, и в результате за последние 15 лет было открыто много новых онкогенных вирусов. Однако за последнее время внимание исследователей сосредоточилось не столько на поиске новых, сколько на изучении свойств уже открытых опухолеродных вирусов, проводящемся на клеточном уровне. Во многом этому способствовали успехи, достигнутые в совершенствовании методов работы с культурами клеток, что позволило разработать количественные методы изучения трансформации клеток опухолеродными вирусами in vitro.

Наиболее тщательному изучению подверглись следующие системы:

1) фибробласты кур, трансформированные вирусом саркомы Рауса (ВСР), и 2) фибробласты млекопитающих, трансформированные ДНК-содержащими вирусами, в том числе вирусом полиомы, вирусом 5У-40 а аденовирусами. Ниже мы сначала рассмотрим каждую из этих систем в отдельности, а затем обсудим возможные общие стадии событий, наблюдаемых при трансформации клеток вирусами. 

6. Саркома Рауса 

Несмотря на то что в период между 1911 и 1955 гг. изучению вируса -саркомы Рауса было посвящено большое количество экспериментальных исследований, многие фундаментальные вопросы, касающиеся как -свойств вируса, например его размера, состава, стабильности, скорости размножения и т. д., так и свойств зараженных им клеток, остались неразрешенными. Содержит ли вирус каждая опухолевая клетка? Может ли клетка продуцировать вирус и одновременно делиться? Очевидно, что получение ответов на эти принципиальные вопросы имеет большое значение.

В 1958 г. Темин и Рубин  разработали метод количественного - определения вируса саркомы Рауса in vitro. В основе предложенного *ими метода лежит явление, ранее обнаруженное Менакером и Групэ. Эти авторы подметили, что нанесение небольшого количества вируса саркомы Рауса на однослойную культуру куриных фибробластов приводит к образованию групп, или фокусов, измененных клеток, число которых можно подсчитать. Этот метод по своей сущности является как бы противоположностью метода подсчета числа бляшек, при помощи которого, как известно, подсчитывают число зон разрушенных клеток, каждая из которых возникает в результате распространения вируса из одной первично зараженной клетки. Метод определения трансформирующей активности вирусов путем подсчета числа «фокусов трансформации» сыграл роль инструмента, пользуясь которым удалось осуществить ряд весьма плодотворных исследований, посвященных изучению взаимодействия клетки с опухолеродными вирусами.

Число фокусов трансформации, образующихся при заражении однослойной культуры куриных фибробластов вирусом саркомы Рауса, прямо пропорционально количеству вируса, введенного в культуру, а это говорит о том, что за образование фокуса трансформации ответственна одна вирусная частица. Вирусы, образуемые клетками, принадлежащими к какому-либо одному фокусу трансформации, можно рассматривать как относящиеся к одному клону. Было показано, что такой чистый клон вируса саркомы Рауса способен трансформировать в саркоматозные мезодермальные и энтодермальные клетки, а также эктодермальные клетки радужной оболочки глаза. Детальное изучение процесса размножения вируса саркомы Рауса, в том числе и методами, позволяющими культивировать отдельные клетки в микрокаплях культуральной жидкости, показало, что большинство клеток, трансформированных этим вирусом, может одновременно и продуцировать вирус и делиться в неограниченном числе генераций. Необходимо подчеркнуть, что пока не было обнаружено другой системы вирус -- клетка, где клетки были бы способны делиться и одновременно продуцировать вирус. Вирусные частицы образуются медленно. Одна клетка продуцирует один вирион примерно за 5 час. Внутри клеток содержится очень мало вирусных частиц, и большая часть вируса, связанного с клетками, нейтрализуется антисывороткой. Этот факт говорит о том, что вирус саркомы Рауса созревает у поверхности клетки, а зрелые вирионы почти немедленно после сформирования выходят из клетки. Такой тип созревания характерен для миксовирусов и арбовирусов.

Одним из наиболее загадочных вопросов, возникших в связи с результатами, полученными при изучении опухолей животных, индуцированных вирусом саркомы Рауса, явилось обнаружение образования опухолей, не содержавших вируса, -- факт, находящийся в противоречии с результатами, полученными при изучении взаимодействия этого вируса с клетками in vitro. Было обнаружено, что при введении животному небольшого количества вируса вероятность образования опухоли, не содержащей вируса, выше, чем при введении большого количества вируса. Причина этого явления, как и ряда других аномалий, наблюдавшихся при изучении трансформации клеток вирусом саркомы Рауса in vitro, была в конце концов выяснена. Оказалось, что вирус саркомы Рауса является дефектным вирусом, вследствие чего для его созревания необходимо присутствие в клетке другого родственного вируса.

История открытия дефектности вируса саркомы Рауса такова. Сначала было обнаружено, что многие куры и куриные эмбрионы заражены некоторыми штаммами большой группы вирусов, вызывающих лейкозы у птиц. Некоторые из этих вирусов вызывают образование опухолей кроветворных органов, но в большинстве случаев у кур и куриных эмбрионов никаких заболеваний не наблюдается. Далее было обнаружено, что клетки, зараженные одним из этих кажущихся безвредными вирусов, приобретают устойчивость к заражению и трансформации вирусом саркомы Рауса. Используя метод количественного определения трансформирующей активности вируса саркомы Рауса (подсчет фокусов трансформации), можно обнаружить и количественно определить содержащийся в системе интерферирующий вирус (фактор, ингибирующий вирус саркомы Рауса -- ФИР). Таким образом удалось отобрать культуры куриных фибробластов, не содержащих ФИР. В свою очередь, используя эти культуры, удалось выявить, какие из имеющихся препаратов вируса саркомы Рауса содержат другие вирусы этой группы, а какие -- нет. Таким путем Рубин в изучавшихся им препаратах вируса саркомы Рауса обнаружил новый вирус, который он назвал Раус-ассоциированным вирусом (РАВ). Этот вирус, подобно ФИР, интерферировал с вирусом саркомы Рауса в образовании фокусов трансформации. Раус-ас-социированный вирус серологически родствен как вирусу саркомы Рауса, так и другим ФИР-вирусам.

Следующей страницей истории изучения вируса саркомы Рауса было обнаружение того, что иммунологическая толерантность к вирусу ФИР играет роль в процессе, контролирующем наличие или отсутствие вируса в опухолях кур, индуцированных вирусом саркомы Рауса. Иммунологическая толерантность к данному антигену является результатом наличия этого антигена в иммунологически незрелом организме . Если данный антиген снова ввести в такой организм после окончательного созревания иммунологической системы, то организм не ответит на его введение образованием соответствующих антител. И действительно, было показано, что если в ранний период развития организма заразить его вирусом ФИР, то курица становится толерантной к вирусу саркомы

Рауса, в результате чего титр этого вируса повышается. Таким образом, титр вируса саркомы Рауса в опухолях, полученных от толерантных кур, значительно выше, чем в контрольных. Более того, в некоторых опухолях, полученных от животных, не толерантных к вирусу ФИР, вирус саркомы Рауса вовсе не удается обнаружить. Опухоли, индуцированные у нетолерантных животных, обычно рассасываются, вероятно вследствие иммунологического отторжения, тогда как у толерантных животных опухоли растут до тех пор, пока не убивают животное.

Очевидно, что конечный результат инфекции, вызванной вирусом саркомы Рауса, и в особенности образование опухолей, не содержащих вируса, зависит от каких-то факторов, родственных ФИР. В связи с этим возникает вопрос: ответственна ли за образование безвирусных опухолей лишь интенсивная иммунологическая реакция организма хозяина или в основе этого явления лежат более тонкие биологические механизмы?

Ответ на этот вопрос был получен при изучении образования вируса клетками, трансформированными при их заражении малым количеством вируса. Было обнаружено, что при разбавлении смеси, содержащей вирус саркомы Рауса (ВСР) и Раус-ассоциированный вирус (РАВ), сильно разбавленные пробы содержат чистый РАВ. Это означает, что в исходном материале концентрация РАВ превышает концентрацию ВСР. Для того чтобы очистить ВСР, Ханафуза и сотрудники вводили в культуру очень небольшие количества вируса (низкая множественность заражения), после чего небольшое количество зараженных клеток переносили в другую чашку. В результате в одной чашке появлялось максимум два-три фокуса трансформации. Для того чтобы предупредить распространение образующегося вируса от клетки к клетке, к культуре добавляли антисыворотку.

Когда клетки, трансформированные ВСР, были выделены и размножены, в результате чего исследователи получили достаточно большое количество линий таких клеток, оказалось, что более 80% линий трансформированных клеток не продуцировали ни ВСР, ни РАВ. Действие