Генная инженерия растений

Тi –плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК длиной ≈ 200 т.н.п. В бактериальных клетках они способны реплицироваться автономно. Тi –плазмиды могут быть разделены на четыре группы по типу синтезируемых ими опинов. Чаще всего встречаются тi –плазмиды, кодирующие аминокислоты нопалин или октопин. Причем агробактериальная клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.

Генетические исследования показали, что Тi- плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: 1). Необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т.д ) 2). Необходимые для трансформации растительной клетки. При этом следует особо отметить, что гены первой группы имеют прокариотический тип промотора и могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы могут работать в растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опинов.

Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит следующим образом. Было показано, что агробактерия не входит в растительную клетку, не входит в нее и Тi-плазмида, но часть Тi-плазмиды переносятся в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Тi- плазмиды был назван Т-ДНК (от англ. Transforming DNA- трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые повторы (25н.п), которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Область Т-ДНК несет семь генов: ген, кодирующий синтез одного из опинов, а также шесть генов, кодирующих признаки опухолеобразования, причем два из них кодируют синтез ауксина, а один- синтез цитокинина. В результате экспрессии этих генов в трансформированных клетках меняется гормональный статус, что приводит к их дифференцировке и опухолеобразованию.[4]

Процесс трансформации растения начинается с того, что агробактерии прикрепляется к растительной клетке в области поражения последней. При поранении растительная клетка выделяет во внешнюю среду специфическое фенольное соединение -ацетосиренгон. Итак, методы в том или ином сочетании позволяют получить многие гены, продукты которых- белки- известны и могут быть выделены хотя бы в малом количестве. Эти гены в дальнейшем могут стать объектом генно- инженерных манипуляций, задача которых получить их экспрессию в новом генетическом окружении.

 

 

 

              

 

 

 

 

 

 

 

 

               II Генетический материал в растений.

               Предпосылки создания изобретения Достижения в области технологии рекомбинантной ДНК совместно с успехами в области трансформации растений и технологии регенерации позволяют вводить новый генетический материал в клетки растений, растения 20 или их ткани, в результате чего реализуется новый признак, например, фенотипы, повышающий ценность растения или ткани растения. Недавняя демонстрация подвергнутых методам генной инженерии растений, устойчивых к действию патогенов (EP-A 240332 и EP-A 223452), или насекомых [Vaeck М. et al., Nature 328, 33 (1987)] , а также создание растений, устойчивых к действию гербицидов [DeBlock М. et al., EMBO J. 6, 2513 (1987)], показывает потенциальные возможности для повышения урожая. Число таких культур достаточно широко: от деревьев и кустарников до декоративных цветов и полевых культур. Термин "культура" охватывает культуру растительной ткани, выращенной в биореакторе в качестве источника аналогичного природного продукта.

               В некоторых случаях желательно контролировать время и/или степень экспрессии введенного генетического материала в растениях, растительных клетках или тканях. Идеальным условием является регуляция экспрессии желаемого признака, созданного методами генной инженерии, с помощью регулирующего промежуточного вещества, который может легко применяться на полевых культурах, декоративных кустарниках, в биореакторах и тому подобное.

 

 

 

2.1. Введение генов в клетки растений.

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых ("рекальцитрантных") к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.

В последнее время был разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.[5]

 

 

 

2.2. Источники генов для улучшения растений.

Генетический код един для всех живых существ. Круг источников генов, которые могут быть использованы для улучшения свойств культурных растений, не органичен миром растений. Гены, выделенные из различных царств, семейств и отрядов живых организмов могут работать в представителях любых других царств, семейств и отрядов.

Например, ген белка GFP, выделенный из морской медузы и светящийся в ультрафиолете, успешно работает в трансгенных растениях, помогая отслеживать процесс трансформации и селекции. Гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, выделенные из микроорганизмов, служат маркерами трансформации в растениях.

Существенно удешевили получение урожая гены устойчивости к гербицидам и насекомым. Известно, что для борьбы с сорными растениями, конкурирующими с культурными, требуются значительные средства. Если иметь культуры, устойчивые к гербицидам, последними можно обрабатывать посевы, и уничтожать сорняки без вреда для культурных растений.

Ген bar, выделенный из бактерии, определяющий устойчивость к гербициду «Баста», был введен и апробирован на ряде важнейших культур, в том числе на злаках и сахарной свекле.

В течение нескольких десятилетий для борьбы с насекомыми использовалась культура бактерий Bacillus thuringiensis (Bt). После обработки этой культурой растения не подвергались атакам насекомым. Оказалось, что действенным началом бактерии являются токсичные для насекомых белки, препятствующие всасыванию пищи.

В таблице 1 представлены данные об источниках генов устойчивости к насекомым-вредителям. Трансгенный картофель с генами Bt показал надежно наследуемую устойчивость к колорадскому жуку и получил широкое распространение в странах, страдающих от этого насекомого. С 1997 года во Франции проводятся испытания трансгенной Bt-кукурузы, устойчивой к стеблевому мотыльку.[6]

 

Таблица 1

Источники генов токсинов из Bt, защищающие растения от насекомых-вредителей.

Разновидности Bt.	Вредители, чувствительные к токсину
Var.tenebrionis u san diego	Колорадский жук, личинки вязового листоеда
Var. kurstaki	Гусеницы капустницы, мешочницы, озимой совки, капустной моли, и др. чешукрылых, личинки европейского кукурузного сверлильщика
Var. ismelensis	Личинки и имаго многих двукрылых
Var. aizavai	Личинки воскового мотылька (вредитель в пчеловодстве), капустного мотылька и др.

Полевые испытания трансгенного картофеля, созданного в лаборатории генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН, показали сохранность признака устойчивости к колорадскому жуку в течение не менее трех вегетативных поколений.

 

 

 

2.3. Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях.

При изучении экспрессии чужеродных генов в растительных клетках исследователи столкнулись с рядом новых явлений. Выяснилось, что трансформированные идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена. Показано, что уровень экспрессии зависит от многих факторов и в значительной мере от того в какую область ядерного хроматина попал введенный ген.

Экспрессия трансгена, как правило высока при его попадании в область активного хроматина. Кроме того, оказалось, что при встраивании в ядерный геном конструкция ДНК нередко претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т.д.), что также приводит в основном к снижению экспрессии.

Было установлено также, что обычно применяемые процедуры трансформации вовсе не безразличны и для хозяйского генома.

Во-первых, встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Во-вторых, при агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокации фрагментов хромосом. Все это также может менять нормальное функционирование генома растения. [7]

Еще одна важная проблема, которая открылась благодаря генетической инженерии растений - это проблема замолкания генов (gene silencing). Было обнаружено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность, хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК.

Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов. Одним из основных факторов является число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Откуда следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 п.о. ДНК) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед трансформацией.

Уровень и стабильность экспрессии трансгенов в растении можно повысить при специальном конструировании концов вводимой ДНК. Так, добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания. При концевом добавлении сравнительно коротких (>300 п. о.) участков связывания ядерного матрикса (MAP) трансген имеет больше шансов образовать независимую петлю хроматина или включиться в состав транскрибируемого эухроматина. В обоих случаях это приводит к повышению и стабилизации уровня экспрессии трансгена.

В ряде случаев, особенно у злаков, введение интрона в район 5'-конца мРНК целевого гена резко усиливает его транскрипцию. Помимо этого, в составе мРНК обнаружены цис-элементы, определяющие степень ее стабильности в растительной клетке. Правильный генно-инженерный дизайн таких элементов может также способствовать оптимальному накоплению мРНК в трансгенных растениях, предназначенных для биотехнологического применения.

Стабильно введенный ген должен передаваться потомству при семенном размножении, поэтому важно определить этот параметр на практике. Уровень транскрипции введенного гена оценивается обычно с помощью традиционного Northern-блотинга или недавно предложенных количественных версий RT PCR (на мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная цепь ДНК, которая и размножается в полимеразной цепной реакции). В ряде случаев экспрессию гена проще и надежнее контролировать по конечному белковому продукту или тому эффекту, который этот белок вызывает.

Однако необходимо использование разных методов для доказательства истинной трансгенности данного растения, чтобы исключить "псевдотрансгенные" черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью или неполной элиминацией агробактерий

Для изучения молекулярной конституции генома трансгенных организмов можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. Метод основан на том, что гомологичные последовательности ДНК гибридов и их родителей при разрезании рестриктазами могут попасть во фрагменты разной длины. В качестве маркеров родительских геномов можно использовать и часто повторяющиеся последовательности ДНК. Повторяющиеся последовательности составляют значительную часть генома типичного растения. Большая часть последовательностей повторяется до 1000 раз на геном. У многих растений выявлены еще более частые повторы (100000 - 1000000 копий на геном), которые составляют до 20% генома. Они имеют отличный от остальной клеточной ДНК "Г - Ц" состав и в градиенте хлористого цезия выявляются в виде сателлитного компонента. В геномах даже очень близких видов амплифицируются разные типы повторов, поэтому они становятся своеобразными "отпечатками пальцев" близкородственных геномов. Высокотандемные последовательности ДНК относительно легко клонируются, так как после расщепления рестриктазой, имеющей сайт узнавания в повторе, эти последовательности легко выявляются в виде полос при электрофоретическом разделении фрагментов и могут быть элюированы из геля в чистом виде. Их можно использовать в качестве зондов. Использование высокоповторяющихся последовательностей в качестве молекулярных зондов позволяет вести одновременный скрининг большого количества образцов грубоочищенной ДНК регенерировавших после слияния протопластов растений или каллусов методом дот-гибридизации.[8]