Физиолого - биохимическая характристика вида Pseudomonas corrugata

     бромфенол синий  - 30 мл

     ксилен  цианола   - 30 мл

     глицерин    - 0,6 мл

     ЭДТА    - 60 ммоль

     H₂O     - до 1 мл 

     4. TAE-буфер (pH 8,0):

     трис-основание                        - 4,84 г

     уксусная  кислота (ледяная)   - 1,142 мл

     0.5М  ЭДТАNa₂ (pH 8,0) - 0,2 мл

     этидия  бромид (10 мг/мл) - 50 мкл

     H₂O дистиллированная         - до 1000 мл 

     5. Агароза (0,8%):

     агароза                                   - 0,8 г

     ТАЕ буфер (pH 8,0)               - до 100 мл 

     2.3 Методы исследования

1. Амплификация ДНК.

1) Ночные культуры исследуемых штаммов с 1,5% агаризированной среды наконечником дозатора вносили в пробирки Эппендорф с 50 мкл дистиллированной стерильной воды и встряхивали. Количество клеток оценивали визуально по степени мутности суспензии.

2) В  пробирку Эппендорф добавляли  реактивы. 
 
 
 
 
 

Таблица 6

Реактивы  для ПЦР 

Общий объём смеси— 172 мкл.

3) Полученную  смесь реактивов разливали по 19 мкл в девять пронумерованных  пробирок Эппендорф, стоящих на льду. В первые восемь пробирок вносили по 1 мкл соответствующих клеточных суспензий. Девятую пробирку оставляли без матрицы, в качестве негативного контроля.

4) Девять образцов амплифицировали по следующей программе:

1. один цикл:

- 94ºC 5 мин;

2. 27 циклов:

- 94ºC 30 сек,

- 62ºC 30 сек,

- 72ºC 1 мин;

3. один  цикл:

- 72ºC 3 мин;

4. Охлаждение до 4ºC.

Пробы хранились замороженными. 

2. Электрофорез ДНК  в агарозном геле.

1) Агарозный гель плавили на водяной бане.

2) В электрофорезный аппарат устанавливали планшетку для лунок, заливали раствором агарозы. После застывания агарозы гребёнку доставали. Планшетку с готовыми лунками заливали буфером ТАЕ.

3) К  размороженным амплифицированным  пробам добавляли 4 мкл 6-кратного  загрузочного буфера. Вносили препараты в лунки.

4) В  десятую лунку добавляли ДНК-маркер, для определения размеров фрагментов.

5) Электрофорез  проводили при напряжении 100В.

6) Гель извлекали из аппарата и визуализировали в ультрафиолетовом свете. 

  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 

     Целью данного исследования была оценка возможности  использования видоспецифичных  праймеров для диагностики Ps. corrugata как возбудителя некроза сердцевины томата. Использовались праймеры, разработанные методом ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК. Образцы были подвергнуты амплификации и электрофорезу.

     Исследовались как выделенные из заражённых растений (37.1, 3’м и 3.2), так и коллекционные.

     Результаты  электрофореза представлены на рисунке 11. 

     Рисунок 11. Результаты электрофореза ДНК. 1— 10864; 2— 9849; 3—DSM 7228; 4— DAR 61730; 5— 37.1; 6— 3’м; 7— 3.2; 8— JMB 9069; 9— негативный контроль; 10— ДНК-маркер. 

     Ожидаемый продукт 1100 п.н. был получен из препаратов штаммов 10864, 9849, DSM 7228, 37.1, 3’м.

     Штамм 3.2 предварительно определён как Ps. corrugate, однако точная видовая принадлежность не установлена.

     Коллекционные штаммы DAR 61730 и JMB 9069 характерного продукта не дали по неизвестным причинам. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     ВЫВОДЫ.

     1. Амплификацию с праймерами PC 1/1, PC 1/2 и PC 5/1, PC 5/2 можно использовать для видового определения бактерий Ps. corrugata.

     2. Использованный тест не универсален, т.к. не все изучаемые штаммы дали характерный для Ps. corrugata продукт амплификации. 

 

    СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

1. И.А.Прищепа, В.В.Вабищевич. Основные бактериальные болезни огурца и томата защищенного грунта. -Несвиж: Несвиж. укрупн. тип., 2008. -52 с.
2. Anzai Y., Kim H.,Park J., Wakabayashi H. and Oyaizu H. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence// Int J Syst Evol Microbiol. -2000. -50. p.1563–1589.
3. Bella P., Greco S., Polizzi G., Cirvilleri G. and Catara V. Soil fitness and thermal sensitivity of Pseudomonas corrugata strains// Acta Hortic. (ISHS). -2003. -614. p.831–836.
4. Basim H.,  Basim E.,  Yilmaz S. and Ilkucan M. First report of pith necrosis of tomato caused by Pseudomonas mediterranea in Turkey// Plant Pathology. -2005. -54, p.240.
5. Catara V., Gardan L. and Lopez M.M. Phenotypic heterogenety of Pseudomonas corrugata strains from southern Italy// Journal of Applied Microbiology -1997. -83. p.576-586.
6. Catara V., Arnold D., Cirvilleri G. and Vivian A. Specific oligonucleotide primers for the rapid identification and detection of the agent of tomato pith necrosis, Pseudomonas corrugata, by PCR amplification: evidence for two distinct genomic groups// European Journal of Plant Pathology. -2000. -106. p.753–762.
7. Catara V., Sutra L., Morineau A., Achouak W., Christen R. and Gardan L. Phenotypic and genomic evidence for the revision of Pseudomonas corrugata and proposal of Pseudomonas mediterranea sp. nov.//  International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. -2002. -52. p.1749–1758.
8. Catara V. Pseudomonas corrugata: plant pathogen and/or biological resource?// Molecular plant pathology. -2007. -8(3), p.233–244.
9. Emanuele M.C., Scaloni A., Lavermicocca P., Jacobellis N.S., Camoni L., Di Giorgio D., Pucci P., Paci M., Segre A. and Ballio A. Corpeptins, new bioactive lipodepsipeptides from cultures of Pseudomonas corrugata// FEBS Lett. -1998. -433, p.317–320.
10. Fett W.F., Cescutti P., and Wijey C. Exopolysaccharides of the plant pathogens Pseudomonas corrugata and Ps, flavescens and the saprophyte Ps. chlororaphis// Journal of Applied Bacteriology. -1996. -81. p.181-187.
11. Gravel V., Martinez C., Antoun H., Tweddell R.J. Antagonist microorganisms with the ability to control Phythium damping-off of tomato seeds in rockwoll// Biocontrol Sci. -2005.  -50. p.771–786.
12. Guo Y., Zheng H., Yang Y., Wang H. Characterization of Pseudomonas corrugata Strain P94 Isolated from Soil in Beijing as a Potential Biocontrol Agent// Curr Microbiol. -2007. -55. p.247–253.
13. Licciardello G., Bertani I., Steindler L., Bella P., Venturi V. & Catara V. Pseudomonas corrugata contains a conserved N-acyl homoserine lactonequorumsensingsystem; it's role in tomato pathogenicity and tobacco hypersensitivity response// FEMS Microbiol. Ecol. -2007. -61, p.222-234.
14. Moura, M.L., Jacques, M.A., Brito, L.M., Mourão, I.M. and Duclos, J. Tomato pith necrosis (TPN) caused by P. corrugata and P. mediterranea:  severity of damages and crop loss assessment// Acta Hort. (ISHS). -2005. -695. p/365–372.
15. Pandey A., Palni L., Hebbar K. Suppression of damping-off in maize seedlings by Pseudomonas corrugata// Microbiol Res. -2001, -156. p.191–194.
16. Scaloni A., Dalla Serra M., Amodeo P., Mannina L., Maria Vitale R., Laura Segre A., Cruciani O., Lodovichetti F., Greco M.L., Fiore A., Gallo M., D’Ambrosio1 C., Coraiola M., Menestrina G., Graniti A. and Fogliano V. Structure, conformation and biological activity of a novel lipodepsipeptide from pseudomonas corrugata: cormicin A// Biochem. J. -2004. -384. p.25–36.
17. Siverio F., Cambra M., Gorris M. T., Corzo J., and Lopez M. Lipopolysaccharides as Determinants of Serologica Variability in Pseudomonas corrugata// American Society for Microbiology. -1993. -59. p.1805-1812.