Физиолого - биохимическая характристика вида Pseudomonas corrugata

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 

Биологический факультет 

Кафедра микробиологии 
 
 
 
 
 

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА

ВИДА  PSEUDOMONAS CORRUGATA 
 
 
 
 

Курсовая  работа

      студента 3 курса

      Землянского В.А. 
 

Научный руководитель:

канд. биол. наук, доцент

Мямин В. Е.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Минск

2010 
ОГЛАВЛЕНИЕ 

Введение             3

1. Обзор литературы           4

      1.1 Характеристика вида         4

      1.2 Внутривидовая гетерогенность        6

            1.2.1 Серологическая  гетерогенность      6

            1.2.2 Выделение Ps. mediterranea       7

      1.3 Некроз сердцевины стебля томата       8

      1.4 Антагонизм         14

            1.3.1 Биологически  активные соединения    16

2. Материалы и методы         17

     2.1 Объекты исследования       17

      2.2 Среды и растворы        17

      2.3 Методы исследования       18

3. Результаты  и их обсуждение       21

Выводы           23

Список литературы         24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ 

     Pseudomonas corrugata— опасный фитопатоген, прежде всего томата. Вызываемые им заболевания наносят серьёзный ущерб сельскому хозяйству. Встречается по всему миру.  Распространённости патогена способствует способность сохраняться в почве и воде. Диагностику затрудняет высокая внутривидовая гетерогенность и, как следствие, неприменимость серологического анализа. Важным инструментом видового определения является ПЦР анализ.

     В данной работе предпринята попытка  применить ПЦР анализ к выделенным из заражённых растений и коллекционных штаммам, ранее отнесённым к Ps. Сorrugata на основе определения нуклеотидной последовательности генов рибосомальной РНК.

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 
 

1.1 Характеристика вида

     Pseudomonas corrugata впервые описаны в 1978 как фитопатоген, ответственный за некроз сердцевины томата в Великобритании. Систематическое положение: царство Bacteria; группа Proteobacteria, γ-секция; порядок Pseudomonadales; семейство Pseudomonadaceae; род Pseudomonas. Сообщения о выделении поступали из множества государств, включая США, Канаду, страны Европы, Южную Африку, Новую Зеландию, Израиль, Китай и Россию. Также идентифицируется в качестве возбудителя некроза сердцевины перца, стеблевой гнили хризантем и некроза сердцевины герани. Бактерии встречаются повсеместно, выделяются из почвы и воды, а также в отсутствие симптомов заболевания из ризосферы пшеницы, корней люцерны и различных частей других растений (табл. 1) (Catara et al., 2002; Guo et al., 2007). 

     Таблица 1

     Источники выделения Ps. corrugata, не проявляющие симптомов заболеваний (Catara, 2007)

 

     Бактерии  Ps. corrugata представляют собой неспороносные подвижные (полярное жгутикование) клетки. Грамотрицательны. На картофельном агаре образуют кремово-коричневые колонии, проявляющие специфический рост: их поверхность складчатая, а края неровные, морщинистые (с этим и связывают видовое название: "corrugata" означает "морщинистый") (рис. 1). Иногда в центре колоний отмечают зелёную окраску. На пептонном агаре с добавлением глюкозы (УДС) бактерии образуют голубой, диффундирующий в среду пигмент. На среде Кинга Б не производят флюоресцирующий пигмент. На глюкозо-дрожжевом агаре колонии плоские желтоато-зелёного цвета и также с неровной поверхностью. Бактерии выделяют в среду желтовато-зелёный нефлюорисцирующий пигмент. Оптимальная температура для роста колоний 26-28ºC. Рост колоний прекращается при температуре более 41ºC. Бактерии характеризуются относительно быстрым развитием на питательных средах: так, на картофельном и пептонном агаре на 4-5 сутки роста колонии достигают размера 2,4-3 и 3,5-4 мм соответственно.  

     

     Рисунок 1. Колонии Ps. Corrugate на питательной среде содержащей глюкозу (Catara, 2007). 

     Разжижают желатин (не все штаммы), не гидролизуют крахмал и L-аргинин, не образуют леван, оксидазо- и лецитиназоположительные. Продуцируют кислоту из галактозы, ксилозы, маннозы, мелибиозы, рибозы, трегалозы, сахарозы, фруктозы, глицерина, инозита, маннита, но не утилизируют лактозу, мальтозу, раффинозу, рамнозу, сорбозу, сорбит, инулит, эритрин, адонит, декстрин, дульцит, целлобиозу. Патоген усваивает из аминокислот и аминов - аргинин, аспарагин, глютамин, гистидин. Не усваивает из солей органических кислот - глюконат. Отмечается вариабельность в отношении ацетата, цитрата, формиата, фумарата, гиппурата, лактата, малата, оксалата, пропионата. Бактерии растут при температуре 37ºC, рост отсутствует при 41ºC (Прищепа, Вабищев, 2008).

     Ps. corrugata не продуцирует флюорисцирующих пигментов, однако на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16s РНК относится к группе флюорисцирующих псевдомонад (группа Ps. fluorescens) (Anzai, et al., 2000).

     Полное определение нуклеотидной последовательности генома Ps. corrugata на данный момент не произведён (Catara, 2007). 

2. Внутривидовая гетерогенность

     1.2.1 Серологическая гетерогенность

     Эксперименты  со 128 штаммами из различных стран  показали высокую серологическую гетерогенность вида. Против типового и двух выделенных в Испании из томата и перца штаммов были получены три типа антител. 83 штамма прореагировали с одним, 6 с двумя и ни один со всеми тремя. 39 изолятов не прореагировали ни с одним. Это делает антигенный анализ малопригодным для диагностики Ps. corrugata, пока не будут выделены специализированные антитела. Высокую гетерогенность связывают с большим количеством типов липополисахаридов мембран (более 10). Корелляций между географическим положением источника или поражаемым организмом и липополисахаридной группой не выявлено. Более того, принадлежащие к одной группе штаммы выделялись из разных растений одной теплицы (Siverio et al., 1993). 
 

     1.2.2 Выделение Ps. mediterranea

     На  основе семи биохимических тестов вид  был разделён на группы и подгруппы (табл. 2). Группа 1 отличается от групп 2 и 3 способностью утилизировать 2кето-D-глюконат, мезо-тартарат, гистамин и DL-глицерат. Группы 2 и 3 разделяют по способности вызывать реакцию гиперчувствительности у табака (Catara et al., 1997). 

     Таблица 2

     Гетерогенность  штаммов (Catara et al., 1997)

Примечание: +/- — 10-89% штаммов положительны 

     В дальнейшем вид был организован  в более крупные ветви А, включающую группы 2 и 3, и В, включающую штаммы группы 1 (соответственно 1a и 1b подгруппы псевдомонад  по Sutra et al., 1997). При амплификации с  видоспецифичными праймерами PC5/1-PC5/2 и PC1/1-PC1/2 (последовательности праймеров случайны, подобраны методом RAPD ПЦР и к функциональным генам не приурочены) были получены различные продукты: 1100 п.о. для группы А(I) и 600 п.о. для группы В(II). (Catara et al., 2000) На основе этих данных штаммы группы В выделены в отдельный вид Ps. mediterranea. Данный вид встречается преимущественно в странах Средиземноморья: Италии, Испании, Франции. (Catara et al., 2002) В 2005 поступили сообщения о выделении Ps. mediterranea из помидоров, поражённых некрозом сердцевины, в Турции и Португалии. При диагностике применялся ПЦР анализ (Basil et al., 2005; Moura et al., 2005). 

     1.3 Некротические поражения сердцевины стебля томата, их характеристика

     Ps. сorrugate вызывает некроз сердцевины стебля (пустостебельность) томата (Lycopersicon esculentum), или бурый некроз сердцевины стебля.

     Появление этого заболевания и его интенсивность  меняются из года в год. Оно обнаружено во многих странах Европы, в Северной Америке и Австралии. В настоящее время этот бактериоз является достаточно распространённой и вредоносной болезнью томата выращиваемого в теплицах без обогрева или обогреваемых только в начале сезона.

     Снижение  урожая в результате преждевременной  гибели растений может составлять 50-80%. Размер потерь в призводственных условиях зависит от срока появления болезни и факторов внешней среды. Наиболее интенсивно это явление наблюдается в самом начале плодоношения. Большие потери урожая возможны при раннем заражении через семена. В этом случае погибает значительная часть растений. В настоящее время отсутствуют устойчивые сорта и гибриды томата к возбудителю заболевания.

     Заболевание особенно сильно поражает мощные растения, с хорошо развитой корневой системой. Пораженные растения всегда очень жизнеспособны, имеют толстые мясистые стебли и крупные листья, хотя часто рост корней блокируется, и они начинают походить на концах на горлышко бутылки. Первоначальные признаки бактериоза наблюдают во время плодоношения (образование второй-третьей кисти): в центральной части долей листа (между жилками) отмечают светлые округло-продолговатые пятна, которые постепенно увеличиваются в размерах, а дольки листа скручиваются кверху (эти симптомы особенно заметны в солнечные дни), рост в это время несколько задерживается. В некоторых случаях фиксируют некроз верхушки центральной доли листьев, который распространяется "языком" вдоль центральной жилки. Пораженные листья имеют вид "обваренных", хотя сохраняют зелёный цвет и у них видны тёмно-зелёные маслянистые жилки.