Физиолого - биохимическая характристика вида Pseudomonas corrugata

     На поверхности больных стеблей наблюдают небольшие пятна продолговатой формы, располагающиеся преимущественно выше уровня почвы на 25-30 см. Позднее (в большинстве случаев) на больных стеблях развиваются некротические полосы тёмно зелёной окраски и длиной 25-50 см, что служит одним из основных симптомов данного бактериоза. При этом возможна сильная мацерация поражённых тканей с разрушением сердцевины, из которой на попречном разрезе легко можно выдавить слизистый экссудат (белой или кремовой окраски). Из рубцов на стебле, остающихся от листьев, также может выделяться бактериальная слизь. На более позднем этапе развития заболевания на стеблях отмечают трешины с пустотами внутри и побуревшей сердцевинной тканью. При микроскопировании такой ткани наблюдают приплюснутые (бесформенные) клетки бурого цвета, в которых видны подвижные бактерии.

     На  стеблях (как в прикорневой части, так и по всей их длине) формируются  адвентивные корни (длиной до 3-7см), меняющих окраску от белой до ржаво-коричневой. Сначала появляется множество мелких изолированных или выровненных бугорков, которые затем растрескиваются, давая возможность расти корням.

     В местах образования адвентивных  корней внутренняя часть стебля полая: создаётся впечатление, что растение тратит содержимое стеблей на их отрастание. Корневая система таких растений обычно не имеет повреждений.

     У зрелых плодов, взятых от больных растений, вокруг цветоножки могут просматриваться  двойные кольца, тёмно-коричневые в  центре и светло-коричневые по переферии. Иногда от внешнего кольца отходят короткие (4-6 мм) лучи, в зоне которых возникают трещины. В ряде случаев на плодах отмечают характерные "сетки" светло-серых жилок (характерно для зелёных плодов). Встряхивание растений приводит к опадению плодов.

     На  симптоматику заболевания оказывают большое влияние условия внешней среды и физиологическое состояние растений. Течение инфекционного процесса бактериоза усиливает высокая температура, которая, как правило, значительно повышается в условиях теплицы в дневное время (с 11 до 15 часов). В этом случае нередко фиксируют быструю гибель растений. Интенсивному проявлению болезни способствуют также перепады дневной и ночной температур, в результате чего образуется конденсационная влага на растениях, а также внесение избыточных норм азотных удобрений. Если для развития болезни складываются неблагоприятные условия, то слабо поражённые растения (с незначительными изменениями сердцевины стебля) могут завершить вегетацию и дать небольшой урожай плодов.

     В ряде случаев фиксируют совместное поражение томата некрозом сердцевины стебля и бактериального рака, что значительно ускоряет гибель растений. При визуальной диагностике и сравнении внешних признаков этих бактериозов используют срез поражённого растения: при некрозе сердцевины стебля наблюдают некроз ткани, при бактериальном раке - потемнение сосудов с выделением бактериальной слизи. Инкубационный период заболевания составляет не менее 18 дней. Инфекция сохраняется на растительных остатках до 5 месяцев (Прищепа, Вабищевич, 2008). 

     

 

     Рисунок 2. Поражённый стебель (photoshelter.com). 
 
 
 

     

     Рисунок 3. Поражённые стебель и плод (erec.ifas.ufl.edu). 

     

     Рисунок 4. Поражённые плоды (hort.cornell.edu). 
 
 
 
 

     

     Рисунок 5. Придаточные корни на стебле (hort.cornell.edu). 

     

     Рисунок 6. Хлороз и увядание листьев (hort.cornell.edu). 

     Резервуаром инфекции служит почва и ризосферы  растений (не только поражаемых). Бактерии сохраняются в песчаных суглинках  лучше, чем в песчаных почвах. В  пустой почве численность бактерий за 10 недель падает (хотя их всё ещё  можно выделить), по сравнению с почвой, в которую были высажены томаты, где численность сохраняется постоянной (Bella et al., 2003). Также распространяется с семенами и водой, что позволяет заболеванию распространяться в безгрунтовых агросистемах.

     Возбудители проникают в ткани растения через повреждения стебля и корней. Бактерии, в первую очередь, колонизируют паренхиму. По мере развития заболевания поражается ксилема и эпидермис, в виде жидких бактериальных выделений.

     Бактерии  адгезируются на клеточных стенках растения с помощью экзополисахаридов— альгиновых кислот, представляющих собой ацетилированные полимеры маннуроновой кислоты с очень низким содержанием мономеров гулуроновой кислоты (рис. 7) (Fett et al., 1996). 

     

     Рисунок 7. Экзополисахаридный матрикс. A— отдельные клетки, 4 часа после заражения; В— волокнистое межклеточное вещество, 12 часов; С— клетки в экзополисахаридном матриксе, 24 часа; D— 96 часов (Catara, 2007).

     Бактерии  имеют N-ацилгомосеринлактоновую систему quorum sensing, как фактор вирулентности (Grazia et al., 2007).

     В целом молекулярные и генетические аспекты вирулентности и патогенности малоизученны. 

4. Антагонизм по отношению к другим микроорганизмам

     Ps. corrugata рассматривается как потенциальный агент биологического контроля заболеваний. Сообщалось об антогонизме против оомицетов рода Pythium, возбудителей мягкой гнили семян томата, при проращивании в минеральной вате (Gravel et al., 2005), и саженцев кукурузы. (Pandey et al., 2001) При исследовании методов биоконтроля Botrytis cinerea, возбудителя серой гнили томатов, был выявлен широкий спектр антифунгальной и антибактериальной активности непатогенного штамма P94. 

     Таблица 3

     Фунгицидные свойства штамма P94 (Guo et al., 2007)

 
 
 
 
 
 
 

     Таблица 4

     Антибактериальная активность штамма P94 (Guo et al., 2007)

 
 
 

     Антипатогенную  активность связывают с выделением ферментов: протеаз, целлюлаз, хитиназ, и антибиотиков (Guo et al., 2007). 

     

     Рисунок 8. Подавление роста Xanthomonas campestris pv. campestris и  Rhodotorula pilimanae (Catara, 2007). 
 
 
 

     1.3.1 Биологически активные  соединения

     Кормицин  А.

     Данное  вещество является липодепсипептидом: состоит из замкнутой в кольцо пептидной части и остатков 3,4-дигидроксиизодекановой кислоты (рис.и9). Вызывает лизис клеток бактерий, животных и растений. В экспериментах проявлял активность против  Bacillus megaterium и Rhodotorula pilimanae. При инъекции в лист табака вызывал некротические повреждения за 24 часа. Также вызывает лизис эритроцитов. Механизм действия основан на встраивании в мембраны, образовании пор и резком повышении пропускной способности мембран. Ведутся исследования, направленные на получение фунгицидов на основе кормицина (Scaloni et al., 2004). 

     Рисунок 9. Структурная формула кормицина А (Scaloni et al., 2004).

 

     Корпептины А и Б.

     Также липодепсипептиды, кислотная часть  представлена 3-гидроксидеканоатом у  кормицина А, и цис-3-гидрокси-5-додеценоатом у кормицина Б (рис 10). Проявляют сходную с кормицином бактерицидную активность и повреждают листья табака (Scaloni et al., 1998). 

     Рисунок 10. Структурная формула корпептина А (Scaloni et al., 1998).

 

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 

2.1 Объекты исследования

     В данной работе использовались штаммы, представленные в таблице 5. 

     Таблица 5

     Использованные  в исследовании штаммы 

 

     2.2 Среды и растворы

     1. Плотная питательная среда:

     агар-агар                                         – 15 г

     питательный бульон                      – до 1000 мл 

     2. Буфер для ПЦР (pH 8,8):

     Трис-HCl    - 650 ммоль

     (NH₄)₂SO₄    - 166 ммоль

     МgCl₂    - Твин 20

     H₂O     - До 10 мл 

     3. Загрузочный буфер (pH 7,6):

     Трис-HCl    - 10 ммоль