Инозиновая кислота

2. Реакція з дифеніламіном (рибоза). До досліджуваного розчину добавляють трьохкратний об’єм 1% розчину дифеніламіну, після чого нагрівають на в киплячий водяній бані на протязі 15 – 20хв. Якщо в розчині наявна рибоза, то розчин забарвлюється в зелений колір. Механізм реакції пов’язаний з гідролізом нуклеїнових кислот при тривалому нагріванні. Отримані при гідролізі пентози утворюють забарвлені комплекси з дифеніламіном.
3. Срібна проба (на пуринові основи, гіпоксантин). До досліджуваного розчину добавляють рівний об’єм 2% аміачного розчину AgNO₃, потім концентрований аміак до лужної реакції (можна перевірити за допомогою індикаторного папірця). Якщо в розчині присутні пуринові основи, то через 5хв випадає рихлий осад срібних сполук пуринових основ, які мають світло-коричневе забарвлення.

         
 

                                                    Світло-коричневий колір

       4.) Молібденова проба  на фосфорну кислоту

       В пробірку вносять 5 крапель реактиву, що містить фосфорну кислоту, добавляють 10-20 крапель молібденового реактиву і кип’ятять на протязі декількох хвилин. При охолодженні пробірки під струєю води випадає кристалічний осад фосфорної солі молібдаду амонію лимонно – жовтого кольору:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃           (NH₄)₃PO₄*12MoO₃*6H₂O + 6H₂O + 21NH₄NO₃

лимонно-жовтий колір

       Приготування  молібденового реактиву: в 100мл дистильованої води розчиняють 7,5 г молібдату амонію і додають 100ил 32%-го розчину            HNO₃ щільністю 1,2 г/см3.

 

Кількісне визначення інозинової кислоти 

       1.) Спектрофотометричне визначення інозинової кислоти

       Методи  кількісного визначення нуклеїнових  кислот, зокрема інозинової кислоти, засновані на спектрофотометрії в ультрафіолетовій області спектру, відрізняються високою чутливістю і простотою проведення аналізу. Інозинова кислота має максимум поглинання в ультрафіолетовому світлі при  249-250 ммк (в кислому середовищі). Коефіцієнт молярної екстензії інозинової кислоти при рН 2 і 250ммк ε = 10 900.

         Необхідним етапом різних методів спектрофотометричного визначення нуклеїнових кислот являється їх екстракція із біологічного матеріалу разом з гідролізом полінуклеотидів. В зв’язку з цим слід мати на увазі, що із досліджуваного матеріалу попередньо необхідно видалити вільні нуклеотиди. В основі модифікації спектрофотометричного метода визначення вмісту нуклеїнових кислот, розробленим А.С. Спіріним, лежить екстракція їх із біологічного матеріалу гарячою хлорною кислотою з послідуючим визначенням поглинання екстрактів в ультрафіолетовій області спектру при 270 і 290 нм.

       Реактиви: 
1. НСlO₄ — 0,2 н. і 0,5 н. розчини.

Здрібнену на холоді наважку тканини (100 – 200мг) поміщують в центрифужну пробірку з 5-10 мл охолодженого 0,2 н розчину  хлорної кислоти. Вміст пробірки ретельно перемішують, осад відділяють центрифугуванням на холоді (3000 об/хв, 10 хв). Центрифугат відкидають і осад повторно відмивають хлорною кислотою. Така попередня обробка матеріалу необхідна для видалення кислото розчинних нуклеотидів.

       Після видалення центрифуга та до осаду  добавляють 5—10 мл 0,5 н. розчину НС1О₄ і, закриваючи пробірки пробками з повітряним холодильником, нагрівають їх в кип’ячий водяній бані на протязі 30хв. Ця процедура забезпечує кількісну екстракцію нуклеїнових кислот з досліджуваного матеріалу і їх кислотний гідроліз до розчинних фрагментів. Гідролізати охолоджують і центрифугують. Осад піддають повторній екстракції 0,5 н. НС1О₄. Гідролізати поєднують і визначають поглинання на спектрофотометрі при 270 і 290 нм против контрольного розчину — 0,5 н. розчину НС1О₄. при необхідності гідролізати розводять тим же розчином.

       Розраховують  вміст фосфору нуклеїнових кислот в 1мл досліджуваного розчину за формулою:

C_мкгФ_н = (А270-А290)/0,19

       Де 0,19 — значення (дельта)А (А270—А290), яке має гідролізат нуклеїнових кислот, що вміщує 1 мкг нуклеїнового фосфору в 1мл розчину.

       При подальших розрахунках враховують загальний об’єм гідролізату і розчинення. Для перерахунку кількості нуклеїнового фосфору на кількість нуклеїнових кислот (інозинової кислоти) користуються середнім перерахунковим коефіцієнтом, що = 10,3.

        
С_мкг (інозинової кислоти) = С_мкгФ_н *10,3

       Рекомендовано проводити додаткове визначення оптичної густини при 260 нм; оптична густина при 260 и 270 нм не повинна розрізнятися більш ніж на 15%.

 

        2.) Визначення загального  фосфору

       Загальним фосфором (Ф_заг) називають весь фосфор, що міститься в даній пробі, тобто суму неорганічного фосфату (Ф_н)  і фосфору, що входить до складу органічних сполук (Ф_орг). Для визначення (Ф_заг) досліджуваний розчин або тканину спалюють (мінералізують), нагріваючи з концентрованою сульфатною кислотою в присутності різноманітних окисників (Н₂О₂, КМnО₄). Найбільш широко використовують пергідроль ( (30%-вий розчин перекису водню). Н₂О₂ при нагріванні легко розкладається і не заважає колориметричному визначенню фосфату

       Рективи: 
1. H₂SO₄ — концентрована.

2. NaOH — 0,5 н. и 5 н. розчини.

3. Пергідроль.

4. Фенолфталеїн — 0,5%-ний спиртовий розчин.

       Мінералізація. Кількість взятого на мінералізацію розчину залежить від вмісту в фосфоровмісній органічній сполуці фосфату, що аналізується і від чутливості використовуваного для визначення фосфату методу.

       При визначенні неорганічного фосфату методом Фіске – Суббароу, який буде розглянутий нижче, на мінералізацію беруть таку кількість досліджуваного розчину, щоб в 1мл отриманого після мінералізації і нейтралізації розчину, вміщувалось від 0,2 до 1,0 мкмоль фосфату. 1—2 мл взятого на аналіз розчину поміщують в невелику колбу для спалювання (колба К’єльдаля) або жаростійку пробірку, добавляють 0,3 мл концентрованої сірчаної кислоти і зафіксувавши колбу (пробірку) злегка під нахилом, обережно нагрівають розчин на горілці, піщаній бані або на спеціальній електричній плитці до тих пір, поки майже повністю випарується вода і розчин в колбі набуде бурого забарвлення (якщо органічної речовини в пробі мало охолоджують, добавляють 2 – 3 краплини пергідролю і розчин знову нагрівають на протязі 5—10 хв. Якщо розчин при цьому побуріє, добавляють нову порцію пергідролю. При додаванні пергідролю треба слідкувати за тим, щоб він попав до розчину а не на стінки колби чи пробірки. Нагрівання при мінералізації не повинне бути занадто сильним, не можна допускати щоб важкі білі пари H₂SO₄ і оксиду сірки виходили з колби, так як разом з ними може частково вилітати і фосфат, що аналізується. Рекомендується проводити мінералізацію у колбах, прикритих скляними втулками або маленькими воронками, які вставляють, коли вода практично вся випариться. Одночасно з пробами, що аналізуються, мінералізацію проводять в контрольній «сліпій» пробі, що містить замість досліджуваного розчину воду. Необхідність контролю обумовлена тим, що реактиви, що використовуються при мінералізації, можуть містити залишки фосфорної, а також кременевої кислоти, наявність яких може зависити результати при визначенні загального фосфору. При розрахунку вмісту фосфату в досліджуваному зразку враховують величину оптичної щільності «сліпої» проби. Якщо значення оптичної щільності велика, реактиви варто змінити.  
Визначення фосфору. По закінченню мінералізації вміст колби кількісно переносять в мірну колбу на 25 мл або в мірну пробірку у на 10 мл, додаючи невеликими порціями воду і ретельно споліскуючи колбу К’єльдаля. Першу порцію води в колбу слід додавати дуже обережно, так як при цьому відбувається сильне нагрівання розчину і створюються умови для гідролізу пірофосфату, який може утворюватися в процесі мінералізації при тривалому нагріванні фосфату з концентрованою сірчаною кислотою. В мірну колбу чи пробірку, заповнену приблизно наполовину розбавленим мінералізатом, додають 1 – 2 краплини фенолфталеїну і нейтралізують кислоту спочатку 5 н., а потім 0,5 н. розчином лугу до слабко рожевого забарвлення, доводять до риски водою і перемішують. З кожної колби відбирають по дві паралельні проби і проводять визначення неорганічного фосфату.

       3.) Метод Фіске - Суббароу

       Метод дозволяє визначити від 0,2 до 2 мкмоль неорганічного фосфату в пробі. В якості відновника в цьому методі використовують систему ейконоген (а-1,2,4-аминонафтолсульфонова кислота)-сульфіт, кислотність 0,75 н.

       Реактивы:  
1. (NH₄)₂Mo0₄—2,5%-вий розчин.

2. Н₂S0₄—5 н. розчин.

3. Молібденовий реактив – суміш рівних об’ємів молібденовокислого амонія(1) і сірчаної кислоти(2).

4. Ейконоген (а-1,2,4-аминонафтолсульфинова кислота).

 Очистка  ейконогену. В 1 л. дистильованої води,підігрітої до 90° С, розчиняють 15 г NаНSОз(Nа₂S₂0₅) і 10 г Nа₂S0з. Потім при постійному перемішуванні 15 г ейконогену (температура розчину — 90° С) і фільтрують гарячим через воронку з нагріванням. Фільтрат охолоджують, додають до нього 10 мл концентрованої НС1, перемішують і фільтрують на воронці Бюхнера. Осад промивають 300 мл охолодженої до 0°С дистильованої води, а потім спиртом. промивають спиртом до тих пір, поки фільтр не стане незабарвленим. Осад висушують на повітрі в темному місці. Зберігають ейконоген в темній склянці.

       Основний  розчин: 250 мг ейконогену, 15 г NаНSОз( або Nа₂S₂0₅) і 0,5 г Nа₂S0з розчиняють в 100 мл води. Робочий розчин ейконогену: 1 об’єм основного розчину і 4 об’єми дистильованої води , добре перемішують і якщо треба фільтрують.

       До  розчину, що містить від 0,2 до 2 мкмоль фосфата, добавляють дистильовану воду до 2,5 мл і 1,5 мл молібденової суміші; вміст пробірок добре перемішують. Потім у всі проби добавляють по 1 мл робочого розчину ейконогену, все знову перемішують і ставлять в водяний термостат при 37°С на 10—15 хв або залишають при кімнатній температурі на 30—40 хв. Після цього розчин охолоджують і фотометрують при 625 нм.

       Вміст фосфату в пробі розраховують по калібровочному графіку. Для побудування  графіку проводять визначення фосфору  в стандартному розчині КН₂Р0₄, відбираючи різну його кількість в межах чутливості даного методу, а саме від 0,2 до 2 мкмоль фосфата в пробі для колориметрування (5 мл).

         4.) Метод Бенцині

       Метод дозволяє виявити від0,02 до 0,16; 0,32 або 0,6 мкмоль неорганічного фосфату в пробі в залежності від приладу, що використовується для визначення (фотометр). Заснований на вимірах інтенсивності поглинання світла при 350 нм комплексом, що утворився після взаємодії фосфату з молібдатом в присутності двохвалентного іону цинку.

       Коефіцієнт  молярного поглинання при 350 нм рівний 7,2-103 М~1 см~1. Реакцію утворення комплексу проводять при рН 5,0, що дозволяє визначити неорганічний фосфат у присутності лабільних фосфорних сполук. Метод відрізняється швидкістю виконання.

       Реактиви (готують на бідистильованій воді):

1. НС1—6 н. розчин.
2. Молібденовий реактив - 15 мМ розчин (NН₄)₂Мо0₄, приготований на 100 мМ розчині ацетату цинку; рН отриманого розчину доводять до 5,0 6 н. розчином НС1. Реактив зберігають при кімнатній температурі в захищеному від прямого сонячного світла місті.
3. Стандартний розчин фосфату (КН₂Р0₄), що містить 0,4 мкмоль фосфату в 1 мл або 1 мкмоль фосфату в 1 мл.

       До  розчину, що містить від 0,02 до 0,16 мкмоль неорганічного фосфату, приливають бідистильовану воду до 0,4 мл, добавляють 1,2 мл молібденового реактиву, перемішують і залишають при кімнатній температурі на 1 хв. Фотометрують при 350 нм в кюветах з відстаню між робочими гранями рівними 1 см. Вміст фосфату в розчині, що досліджується, розраховують за калібровочним графіком, який будують з використанням стандартного розчину фосфату, що містить 0,4 мкмоль в 1 мл.

       При роботі на спектрофотометрі об’єм  проб, що фотометруються і вміст  в них фосфату подвоюють, залишаючи  без змін співвідношення об’ємів  розчину фосфату і молібденового реактиву рівним 1 : 3. В цьому випадку визначають до 0,32 мкмоль фосфату у пробі.

 

        Висновок

       В даній курсовій роботі йшлося про  можливі методи аналізу харчової добавки Е630 (інозинової кислоти), які  безпосередньою дозволяють контролювати якість цієї добавки перед її застосуванням  у харчовій промисловості. Було визначено те, що ця добавка належить до класу «Нуклеїнові кислоти», тобто являється нуклеотидом, всі реакції виявлення якого засновані на визначенні його складових частин, а саме гіпоксантину (пуринової основи), рибози (вуглеводню) та фосфорної кислоти, яка неодмінно входить до складу любої нуклеїнової кислоти.

       Було  вказано ряд методів кількісного  виявлення неорганічного фосфату  в складі інозинової кислоти за допомогою  молібденового реактиву, спектрофотометричним методом. А також були наведені гігієнічні норми та показники якості даної кислоти, гранично допустима концентрація (ГДК) її при використанні в харчових продуктах та допустимий вміст домішок токсичних елементів та важких металів.