Ферментация

   Сепараторы  делятся на 4 группы:

   1) осадительные, состоящие из ротирующего горизонтального цилиндра конической формы с расположенным внутри ротирующим (с меньшей скоростью) шнеком. Обрабатываемый материал вводится в центре, жидкая фракция выводится из конца цилиндра с большим диаметром, густая — из другого конца, с    меньшим диаметром;

   2) кларификаторы с увеличенным объемом седиментационного пространства;  густой  продукт  выгружается  во  время  остановки машины;

3. саморазгружающиеся с пакетом конических тарелок и системой периодической выгрузки густой фракции в процессе работы;
4. форсуночные, также имеющие пакет конических тарелок и систему непрерывной выгрузки густой фракции через форсунки во время работы.

   Технологические схемы, по которым работают сепараторы, зависят от свойств обрабатываемого и целевого продукта и отличаются  разнообразием;  нередко  прибегают к  последовательному включению сепараторов различных конструкций. С обработкой полупродуктов способом сепарирования связано получение хлебопекарных и кормовых дрожжей (в том числе из парафинов, метанола, этанола), медицинских антибиотиков, этилового спирта, дрожжевого экстракта, продуктов из зеленых водорослей, ферментов, аминокислот, витамина В₁₂, вакцин, стимуляторов роста и средств защиты растений и многих других продуктов химико-фармацевтической, медицинской, микробиологической и пищевой промышленности.

   Широко  описаны и эксплуатируются дрожжевые сепараторы (4-я группа).

   Основные  проблемы, связанные с процессами сепарирования, "заключаются в  создании эффективных сепараторов  для выделения бактерий и других мелких частиц с определяющим размером 0,5— 1,0 мкм и меньше, а также  в обеспечении непрерывности  операций, включая мойку и настройку  форсунок и разгружающих систем с  учетом свойств материала. Создает  трудности обработка больших  количеств культуральных жидкостей (при производстве кормового белка, кристаллических аминокислот и др.). Процесс осложняется и в случаях, когда переработке подвергается и фугат, т. е. когда необходимо его осветление, а также при фракционировании мицелиальных культур. Для сепарирования бактерий и осветления жидкостей применяются специальные аппараты из 3-й группы, с пакетом тарелок. Биомасса или твердые частицы собираются в камере с наружной стороны тарелок, откуда они периодически эвакуируются (с остановкой машины или без остановки). Мицелиальные культуры чаще всего фильтруются.

   Фильтрование  является менее энергоемким, но одновременно и менее интенсивным процессом по сравнению с сепарированием. Фильтрованию поддаются далеко не все культуральные жидкости; многие из них имеют свойство быстро закрывать (засорять) поры фильтрующего материала. Иногда специально меняют культуру, чтобы культуральная жидкость поддавалась фракционированию фильтрованием (например, процесс «Пэкилло», Финляндия).

   В качестве оборудования для фильтрования применяют фильтр-прессы различной  конструкции, барабанные вакуумные  фильтры, ленточные фильтр-прессы и  другие конструкции, например ФПАКМ 5,0 (площадь поверхности фильтрации 5 м²), ФПАКМ 2,5 (2,5 м²).

   Для улучшения показателей фильтрации в фильтрах периодического действия используют вспомогательные фильтрующие материалы (ВФМ), которые на поверхности фильтрации образуют грунтовой фильтрующий слой. При отделении биомассы от культу-ральной жидкости актиномицетов — продуцентов антибиотиков толщина грунтового слоя составляет 2,5 мм, а расход наполнителя при максимальной скорости фильтрации — 8%. Первые 15—20 с процесс соответствует фильтрации с закупориванием пор намывного слоя, а далее протекает по типу фильтрации с накоплением осадка, что резко повышает ее скорость. Правильный выбор режима фильтрации определяет скорость фильтрации, расход фильтровального порошка, влажность мицелиального осадка и, соответственно, потери целевого продукта.

   При производстве ферментных препаратов, особенно из бактериальных культур, для фильтрации культуральной жидкости используют ВФМ типа кизельгур (диатомит, инфузорная земля), бентонит, микрозил, фильтроперлит. Широкое применение находит фильтроперлит, однако не все ферменты индифферентны к нему.

   Полученные  после отделения биомассы фильтраты  содержат наряду с целевым продуктом  органические и неорганические вещества, белки как в растворенном, так и в коллоидном состоянии. По существу, культуральная жидкость представляет собой коллоидную систему, коагуляцию которой можно вызвать добавлением электролитов и неэлектролитов, изменением температуры, механическим воздействием и действием акустического поля.

   Коллоидные  и взвешенные частицы имеют отрицательный  заряд и обладают существенной электрофоретической подвижностью; поэтому эффективным способом коагуляции коллоида может быть обработка его катионогенными коагулянтами.

   Для выделения, очистки и фракционирования физиологически активных веществ, в  частности антибиотиков, все чаще используют полимерные реагенты-флоккулянты. В отличие от неорганических электролитов и тепловой обработки флоккулянты  позволяют проводить предварительную очистку культуральных жидкостей в более «мягких» условиях.

   При выделении ферментов к стадии предварительной обработки культуральной  жидкости можно отнести процесс  осаждения сульфатами протамина  или стрептомицина нуклеиновых  кислот, затрудняющих дальнейшее фракционирование белка. Немаловажную роль играет вязкость обрабатываемых растворов, значительно возрастающая в присутствии нуклеиновых кислот. При выборе способа осаждения нуклеиновых кислот необходимо руководствоваться достигаемым эффектом снижения вязкости раствора, полнотой удаления нуклеиновых кислот и степенью сохранности основной активности. Некоторые авторы высказываются против применения сульфатов протамина и стрептомицина как осадителей нуклеиновых кислот, основываясь на их высокой стоимости, и предлагают обработку нуклеазами. При относительно термостабильных белках предусматривается термообработка. Нагревание суспензии дезинтегрированных пекарских дрожжей в течение 20 мин при 50^СС и биомассы Е. coil в течение 5 мин при 55^СС приводит к удалению 85% нуклеиновых кислот. Повышение концентрации ионов Н+ вызывает денатурацию и осаждение нуклео-протеидов и неактивного белка, однако эта процедура требует особой осторожности и знания параметров стабильности выделяемого вещества. Изменение рН обрабатываемых растворов может не только служить способом удаления балластных белков, но и приводить к инактивации нежелательных сопутствующих активностей.

   Как видно из сказанного, методы обработки  культуральных жидкостей очень  разнообразны и специфичны, поэтому  мы ограничимся рассмотренными общими принципами и приведенными примерами.

   ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ БИОМАССЫ

   В том случае, если целевые продукты содержатся в биомассе (внутриклеточные  метаболиты), необходимой технологической  операцией является дезинтеграция.

   Основной  критерий  качества  дезинтеграции  —  максимальное сохранение   структуры   и   функций   компонентов   клеток    (органелл,     биополимеров,     физиологически     активных     веществ).

   Большое количество клеточных компонентов  обусловливает разнообразие целей  и методов дезинтеграции микробных  клеток. Эти методы разделяются на физические (механические), химико-экстрактивные  и физиолого-биохимические. Дезинтеграция  может быть одно- и многооперационной.

   Из  сотен известных способов дезинтеграции  большинство  составляют механические. Среди  них преобладают  баллистические методы, хорошо управляемые и обладающие сравнительно хорошими технико-экономическими показателями.     Серийный выпуск механических дезинтеграторов    организован в ФРГ, Швейцарии, США и других странах.   

   Выбор метода дезинтеграции зависит от свойств конкретной культуры и необходимого продукта, метода дальнейшей обработки  дезинтегратов, цели дезинтеграции (аналитическая, производство) и ряда других факторов.

   Для аналитических целей весьма часто  применяют экструзион-ные дезинтеграторы с замораживанием продукта. Механическая дезинтеграция микроорганизмов широкого заводского применения еще не нашла. Чаще используются химико-экстракционные и физиолого-биохимические методы.

   При выделении внутриклеточных метаболитов  микроорганизмов физиолого-биохимическими способами разрушение клеточной оболочки осуществляется, безусловно, наиболее мягким образом (например, расщепление клеток при помощи литических ферментов).

   Ферментативный  способ дезинтеграции клеток особенно полезен при выделении субклеточных структур, которые могут разрушаться при дезинтеграции клеток механическими или химическими способами.

   Развитие  методов ферментативной дезинтеграции  сдерживается сравнительно высокой стоимостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищенных литических ферментов. Литические ферментные препараты обычно малостабильны и нестандартны. Один из путей преодоления этих трудностей — применение иммобилизованных ферментов.

   Фракционирование  дезинтеграторов (как и сами методы дезинтеграции) очень специфичны, поэтому подробнее на этих вопросах останавливаться не будем.

   ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ

   Одной из перспективных товарных форм продуктов  биотехнологии являются концентраты, которые представляют собой сухой остаток (включая биомассу) культуральных жидкостей, частично обработанный (стабилизация, очистка, концентрирование и др.) или без предварительной обработки. В виде концентратов выпускаются ферменты, аминокислоты, витамины, кормовые антибиотики, бактериальные препараты, гидролизаты белков и др. Основной особенностью концентратов является наличие кроме целе вого компонента ряда сопутствующих веществ — остатков питательной среды, агентов регулирования рН и пеногашения, водорастворимых побочных метаболитов и др.

   Концентраты могут быть жидкими, порошкообразными и в виде смесей с наполнителями. Они гигроскопичны, слипаются и спекаются, так как экстрацеллюлярная часть культуральных жидкостей при обезвоживании сохраняет аморфное состояние. Вследствие этого сорбция влаги происходит по механизму абсорбции, т. е. сопровождается гидратацией ионов и молекул во всей массе препарата — по существу, происходит образование раствора.

   ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАСС (КОРМОВЫХ, ОСЛАБЛЕННЫХ  И ЖИВЫХ)

   Кормовые  биомассы (инактивированные), главным  образом кормовые дрожжи, получают путем сепарирования культуральной  жидкости, плазмолиза клеточной массы, упаривания, высушивания и расфасовки. Хлебопекарные дрожжи производят без плазмолиза и упаривания. Производства кормовых дрожжей являются самыми крупнотоннажными в биотехнологии, действуют сотни заводов, доступны многие книги по технологии их получения. Поэтому мы ограничимся лишь упоминанием этого вида биотехнологической продукции. Менее традиционные разделы классической биотехнологии — производство вакцин, бактериальных удобрений, молочно-кислых бактерий, силосных заквасок и ряда других широко известных препаратов также в достаточной степени описаны ранее.

   ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ  РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ  ОЧИСТКИ

   Эта группа продуктов самая крупная. Наиболее широко применяемыми методами выделения и химической очистки являются экстракционные, ионообменные методы и осаждение. Отличительная особенность всех методов — большое количество технологических    стадий  (неоднократное    отделение — фильтрация осадков, двух- и трехступенчатое экстрагирование, кристаллизация, концентрирование растворов вакуум-выпариванием, применение различных методов сушки и т. д.), разнообразие и сложность используемого оборудования, его разномасштабность (на первых стадиях объемы — до сотен кубических метров, а на последних — иногда несколько десятков литров). Так, например, применяются вакуум-барабанные фильтры, фильтр-прессы, друк- и нутч-фильтры, сепараторы и центрифуги различной производительности, экстракторы различных конструкций, ионообменные колонны, пленочные испарители разных систем, сушильные установки, работающие по принципу распыления, псевдоожижения, сублимации .льда, и другие виды оборудования. Поскольку, например, антибиотики — сложные органические соединения, — как правило, малостабильны и чувствительны к воздействию внешней среды (повышенная температура, изменение рН растворов и т. д.), то процессы химической очистки должны проводиться в условиях, максимально обеспечивающих стабильность препаратов.

   Получение лекарственных препаратов высокой степени чистоты, особенно для инъекций, предъявляет ряд специфических требований к санитарным условиям производства. Конечные стадии (сушка, фасовка) должны проводиться в асептических условиях, для чего необходимы не только специальная обработка оборудования, вспомогательных материалов, помещений, соответствующая подготовка обслуживающего персонала, но и введение дополнительных технологических приемов, например очистки поступающего в помещения воздуха.