Бумажная хроматография

5.КОЛИЧЕСТВЕННАЯ  БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 
Существует несколько способов количественного анализа посредством БХ. Можно экстрагировать зоны с хроматограммы и затем провести количественный анализ методом колориметрии, флуориметрии, адсорбционной спектроскопии, полярографии, радиометрии, биологических испытаний и т. д. или сначала обнаружить вещества на бумаге путем опрыскивания, т. е. по цветной реакции, а затем экстрагировать и исследовать колориметрически. В последнем случае требуется проводить обнаружение возможно более квалифицированно, равномерно и непрерывно нанося реагент на всю хроматограмму. Только таким Образом можно получить правильную калибровочную кривую. Поэтому лучше погрузить хроматограмму в обнаруживающий реагент, а не опрыскивать ее. Можно также сделать пятна видимыми с помощью эффективного метода обнаружения (см. выше) и провести денситометрическое исследование их, применив подходящий денситометр. Денситометрию можно проводить в отраженном или проходящем свете. В первом случае нулевая линия (линия фона) получается более правильной; в проходящем свете бумага выглядит мутной, и поэтому нулевая линия не выходит достаточно ровной. В этом случае также необходимо строить калибровочную кривую по стандартным пробам и с ее помощью определять количество данного компонента. Вместо непосредственного денсйтометрического исследования можно также сфотографировать или иным подходящим способом скопировать хроматограмму и проводить денситометрирова-ние не самой хроматограммы, а ее негативной или позитивной копии. Учитывая неоднородность (мутность) бумаги, многие авторы применяют метод просветления хроматограмм перед ден-ситометрией, пропитывая хроматограммы парафиновым маслом. После того как денситометрирование закончено, необходимо провести оценку записанных денситометром пиков, сравнив их с пиками стандартных проб, т, е. с построенной по стандартным пробам калибровочной кривой. Иногда достаточно измерить высоту пиков, но чаще всего именно площадь между контуром пика и нулевой линией пропорциональна количеству вещества. Эту площадь можно определить планиметрированием, можно также скопировать хроматограмму, вырезать пики и взвесить их, можно также воспользоваться, как предлагают Турина и др. [131]1, методом Монте-Карло. Площадь пиков правильной формы можно определить расчетным путем, умножая высоту пика на его полуширину, или другим подобным методом. 
 
6.БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОРОДСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ 
В первом приближении полярность и хроматографическая подвижность соединений, содержащих, кроме атомов углерода-и водорода, только атомы кислорода, определяется соотношением числа атомов углерода и кислорода в молекуле. Чем выше это соотношение, тем более липофильно вещество, и наоборот (см. разд. 3.1.3). Например, у стеарилового спирта (атомарное отношение С/0 = 18) преобладает липофильный характер. Это соединение совсем не растворяется в воде, но легко растворяется в петролейном эфире. В то же время метиловый спирт (С/0=1) образует две фазы при смешивании с петролейным-эфиром (особенно с его высшими фракциями) и полностью смешивается с водой. Другими примерами подобного рода могут служить гексиловый спирт (С/О = 6) и гексозы (С/0=1). Первый плохо растворим в воде, но легко растворяется в липофильных растворителях, а для гексоз справедливо обратное. Следует однако иметь в виду, что не все кислородсодержащие функциональные группы одинаково влияют на полярность, т. е. на гид-рофильность. Наиболее гидрофильна гидроксильная группа, за-ней следуют альдегидные и кетонные группы, а далее кислород простых или сложных эфиров. Карбоксильная группа по своей полярности подобна гидроксильной, однако она несколько менее гидрофильна в кислотных липофильных системах, тогда как. в основных растворителях ее вклад в гидрофильность молекулы значительно больше, потому что она переходит в карбоксилат-анион, который, конечно, значительно более полярен. 
Соединения с простыми эфирными группами обнаруживаются значительно труднее, чем соединения со сложными эфирными и гидроксильными группами или с двумя и тремя гидроксильными группами, если только это не вицинальные группы. Соединения с енольными группами обнаруживаются (индикаторами РеС13) легче, чем соединения с фенольными группами (связыванием диазониевыми солями, РеСЬ), карбонильными и карбоксильными и двумя вицинальными гидроксильными группами. 
Ниже мы приведем примеры разделения и обнаружения кислородсодержащих соединений, в которые входят отдельные: группы. 
 
7.БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ 
 
В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидроли-затов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменни-ков (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. 
Если не требуется хроматографировать пептиды, то надо с помощью гидролиза отделить аминокислоты от пептидов или белков. Чаще всего для этого применяют кислотный гидролиз, в результате которого триптофан разлагается полностью, а цистин, треонин, серии и иногда тирозин частично. Лучше всего проводить гидролиз 6 н. соляной кислототe. 
 

Список литературы : 
1. Зеленин К.Н. Газовая хроматография в медицине // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 11. С. 20-25. 
2. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981. 
3. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965. 
4. Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Москва Н.А., Левинсон Ф.С. 5-Хлор-4,6-динитробензофуразан как реагент в тонкослойной хроматографии ароматических аминов // Завод. лаб. 1992. Т. 58, № 4. С. 11-13. 
5. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. под ред. О. Микеша пер. с англ., т. 1, М., 1982, с. 58-151.